细菌染色和涂片观察的方法

关于细菌染色和涂片观察的方法第一节

不染色标本检查法所谓不染色标本检查法是将细菌标本不经染色直接镜检，从而观察生活状态下细菌的形态及运动状况的一种检查方法。这种检查方法虽可看到细菌的大致轮廓，但主要用于观察细菌的动力。第2页,共49页，2024年2月25日，星期天一、不染色标本检查法的具体方法1、压滴法2、悬滴法3、毛细管法第3页,共49页，2024年2月25日，星期天第二节

染色标本检查法所谓染色标本检查法是用特殊的手段对细菌进行染色，而后再检查其形态、大小、排列方式、染色反应以及特殊结构的一种检查方法,有助于细菌的初步识别或诊断。第4页,共49页，2024年2月25日，星期天

细菌染色的一般程序细菌染色的基本程序是：涂片→固定→（媒染）→染色→（脱色）→（复染）第5页,共49页，2024年2月25日，星期天1、涂片制备：

随标本的种类而略有不同。一般临床标本大多可直接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面，在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。第6页,共49页，2024年2月25日，星期天2、固定：染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常不易使染料透入细胞内）。固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞、重金属盐或氧化剂等进行固定。第7页,共49页，2024年2月25日，星期天3、媒染：媒染的目的是增加染料和被染物的亲和力。凡使染料固定于被染物；或引起细胞膜通透性改变的物质统称为媒染剂。常用的媒染剂有明矾、苦味酸、金属盐、碘等。也可用加热法媒染。媒染剂可用于固定之后，亦可含于固定液或染液中，也可在初染之后复染之前进行。第8页,共49页，2024年2月25日，星期天4、染色：随目的而选用适宜的染液。染色时，滴加染液以覆盖涂面为度，染色时间随方法而定。单染法只用一种染料如吕氏美兰、稀释石炭酸复红等；而多数染色法需用第二种染液进行复染。第9页,共49页，2024年2月25日，星期天5、脱色：脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为鉴别染色之用。凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负电荷，故可作碱性染料的脱色剂。第10页,共49页，2024年2月25日，星期天6、复染：已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以复染也称为对比染色。复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对比作用。第11页,共49页，2024年2月25日，星期天常用染色法细菌的常用染色法有：单染色法、复染色法、特殊结构染色法、负染色法以及荧光染色法等。第12页,共49页，2024年2月25日，星期天（一）、单染色法：

单染色法是指用一种染料进行染色的方法。如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别价值不大。第13页,共49页，2024年2月25日，星期天（二）、复染色法：

复染色法是用二种以上染料进行染色的方法。此法除显示细菌的形态、大小外，还有鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染色法。常用的鉴别染色法有革兰氏染色法及抗酸染色法。第14页,共49页，2024年2月25日，星期天1、革兰氏染色法（Gram’sStain）是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是由丹麦细菌学家ChristianGram氏于1882～1884年发明的，至今已逾百年，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色方法。第15页,共49页，2024年2月25日，星期天（1）、革兰氏染色的方法：第16页,共49页，2024年2月25日，星期天固定—→初染—→媒染—→脱色

（结晶紫或龙胆紫）（卢戈氏碘液）（95%酒精）—→复染

（稀释复红）第17页,共49页，2024年2月25日，星期天

固定初染媒染脱色复染

革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP”

（Gram’sPositive）表示。

革兰氏阴性菌，用符号“G¯”或“GN”（Gram’sNegative）表示。

第18页,共49页，2024年2月25日，星期天第19页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阳性葡萄球菌例子(金黄色葡萄球菌x1000)第20页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阳性链球菌例子第21页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阴性杆菌例子(大肠杆菌x1000)第22页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阴性弧菌例子第23页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阳性产芽孢杆菌例子第24页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阳性短杆菌例子(李斯特菌x1000)第25页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阴性弯曲菌例子第26页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阳性棒状杆菌例子第27页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件、操作技术及菌龄等有密切的关系。培养基成分：在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳性菌可变为革兰氏阴性菌。培养条件：在酸性环境中细菌带正电荷。操作技术：如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴性菌则可染成革兰氏阳性菌；脱色时倘酒精作用时间太长，革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌。菌龄：菌龄也能影响染色的结果，这和细菌生长过程中核酸含量的改变有关。例如本是革兰氏阳性的老龄菌，因核酸减少则常有许多菌细胞变为革兰氏阴性。第28页,共49页，2024年2月25日，星期天革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量较多，脂类较少，与95%酒精接触后可迅速导致细胞壁脱水，通透性降低，使在细菌细胞内着色的染料——结晶紫与碘的复合物不易透出，所以保留了紫色。而革兰氏阴性菌细胞壁含肽聚糖较少、脂类较多，与95%酒精接触后肽聚糖脱水不明显，而脂类被酒精溶解后使细胞壁通透性增加，酒精易透入菌体内溶解染料——碘复合物并使其透出，因而使紫色被洗脱后又被染成红色。第29页,共49页，2024年2月25日，星期天3）、革兰氏染色法的临床意义①、鉴别细菌：该染色法可将细菌分为GP菌与GN菌两大类，这样可以初步识别细菌、缩小范围，便于进一步鉴定。②、了解细菌与致病性的关系：大多数GP菌的致病物质主要为外毒素；而大多数GN菌的致病物质主要为内毒素。通过革兰氏染色，可了解细菌的致病物质，从而做出相应的治疗对策。第30页,共49页，2024年2月25日，星期天③、选择抗菌药物：GP菌和GN菌在细胞壁等结构上有很大差别，因而对抗菌药物的敏感性不同。如大多数GP菌对青霉素、红霉素、头孢菌素等敏感；而大多数GN菌对这几种抗生素不敏感，但对链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素等敏感，故临床上可根据病原菌的革兰氏染色性，选择有效的药物进行治疗。第31页,共49页，2024年2月25日，星期天2、

抗酸染色法有些细菌如结核杆菌、麻风杆菌等分枝杆菌，用一般染色法不易着色，必须使用强染色剂（如石炭酸复红）并采用加热和延长染色时间的方法才能使其着色。且一旦染上颜色后又不易被酸性酒精脱色。这种能够抵抗酸性酒精脱色的细菌，称为抗酸杆菌。应用这种原理进行染色的方法叫抗酸染色法。抗酸染色法常用的有萋—纳二氏染色法和潘本汉氏染色法。第32页,共49页，2024年2月25日，星期天①染色的步骤：

直接涂片法第33页,共49页，2024年2月25日，星期天夹层杯液基集菌法：第34页,共49页，2024年2月25日，星期天固定——→初染——→脱色——→复染石炭酸复红加热3%盐酸酒精吕氏美兰第35页,共49页，2024年2月25日，星期天染色过程中的细菌颜色变化：抗酸杆菌非抗酸杆菌第36页,共49页，2024年2月25日，星期天第37页,共49页，2024年2月25日，星期天镜检与报告：

用光学显微镜镜检(目镜10×，油镜100×)染色痰片。在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。所见结果按下列标准报告：1)抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。

2)抗酸杆菌(1+)：1～9条抗酸杆菌／100视野。

3)抗酸杆菌(2+)：l一9条抗酸杆菌／10视野。

4)抗酸杆菌(3+)：1～9条抗酸杆菌／每个视野。

5)抗酸杆菌(4+)：≥10条抗酸杆菌／每个视野。第38页,共49页，2024年2月25日，星期天③

抗酸染色的意义：用以鉴别抗酸菌（如结核杆菌和麻风杆菌）和非抗酸菌。第39页,共49页，2024年2月25日，星期天（三）、特殊结构染色法细菌的某些基本结构如细胞壁、核质、胞浆颗粒和特殊结构如荚膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易着色，须用一些特殊染色法才能染上颜色。特殊染色法主要有荚膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、异染颗粒染色法等。这些染色法不仅能使特殊结构着色，还可使特殊结构染成与菌体不同的颜色，有利于观察和区别。第40页,共49页，2024年2月25日，星期天第41页,共49页，2024年2月25日，星期天第42页,共49页，2024年2月25日，星期天在细菌检验工作中，除异染颗粒染色法较常用外，由于其它特殊结构染色法操作费时，费用较高、染色过程要求非常严格，而普通染色法虽不能使特殊结构本身着色，但菌体着色后，荚膜和芽孢部分由于不着色也能显示出来，再加上特殊染色法比较复杂，故日常工作中较少使用这些特殊结构染色法第43页,共49页，2024年2月25日，星期天第44页,共49页，2024年2月25日，星期天第45页,共49页，2024年2月25日，星期天（四）、负染色法

所谓负染色法是指使背景着色而细菌本身不着色的一种染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如刚果红或水溶性苯胺黑等进行染色。因酸性染料带负电荷，而细菌本身在近乎中性的环境中也带负电荷，同种电荷相排斥，故染色时菌体不着色，而只能使背景着色