小鼠免疫抑制模型的建立及其免疫功能检测

论文免疫抑制模型的建立及其免疫功能检测学院：临床医学院专业：临床医学七年制学号：姓名：小鼠免疫抑制模型的建立及其免疫功能检测摘要：目的利用环磷酰胺（CTX）构建小鼠的免疫抑制模型，并检测其免疫功能。方法用OVA作为抗原免疫小鼠，再用CTX进行免疫抑制，加强免疫后，进行免疫功能检测。结果OVA抗原刺激的小鼠均有免疫反应，注射了CTX的小鼠出现免疫功能下降，但抑制效果不佳，仍可检测到免疫功能。结论小鼠免疫抑制模型未建立成功，但是可证实给正常小鼠注射CTX可以减弱其免疫功能。关键词：环磷酰胺免疫抑制模型免疫功能检测TheestablishmentofimmunosuppressivemodelandimmunefunctiontestingWenXingguiAbstract：ObjectiveUsingcyclophosphamide(CTX)constructsamodelofimmunosuppressivemice,andtesttheimmunefunction.MethodUsingOVAasantigenstimulatemice,andinhibitthefunctionofimmunesystem,afterstrengthentheimmuneresponse,testtheimmunefunction.ResultThereareimmuneresponsesinmicewhicharestimulatedbyOVA,butthere’snoimmuneresponseinthemiceinjectedCTX.ConclusionInjectingCTXtonormalmicecanconstructimmunosuppressivemodel.Keywords：CTX，Immunosuppressivemodel，Immunefunctiontesting环磷酰胺(cyclophosphamideCTX)作为一种细胞毒化疗药物，同时也属于烷化剂类免疫抑制剂，其作用主要是破坏DNA的结构，从而阻断其复制，导致细胞死亡。而在免疫毒理学中，环磷酰胺是制备免疫抑制模型的常用药物[1]。本实验利用环磷酰胺的免疫抑制作用，对ICR小鼠进行免疫抑制，然后通过检测其细胞免疫功能、体液免疫功能、吞噬细胞功能检测其免疫功能，检验免疫抑制模型是否建立成功。1.材料与方法1.1材料1.1.1实验动物：ICR小鼠，♀，20-22g，清洁级，购于吉林大学实验动物中心。1.1.2主要试剂：CTX（山西普德药业有限公司）、生理盐水、以氢氧化铝为佐剂的卵清蛋白（OVA）抗原活性物质、5%FCS-IMDM培养液、刀豆蛋白（ConA）（10µg/ml)、白细胞计数液（2%冰醋酸）、MTT（5mg/ml)、二甲亚砜（DMSO)、磷酸盐缓冲液（PBS）、PBS-Tween20洗液、BSA封闭液、酶标抗体（HRP-GaM）、显色底物、终止液（H2SO4）、3%淀粉溶液、印度墨汁1.1.3主要仪器：无菌96孔培养板、细胞计数板、显微镜、细胞培养箱（37℃5%CO2)、酶标仪、离心机、超净台、水浴箱、稀释板、酶标板、培养箱43℃1.2方法1.2.1免疫抑制模型的建立将清洁级ICR小鼠按图1随机分为四组。初次免疫，第1天，NS-NS、CTX-NS组按0.5ml/只注射生理盐水（NS），NS-OVA、CTX-OVA组按0.5ml/只注射OVA-AL(OH)3。分别在第8、10、12、14天给CTX-OVA、CTX-NS组按100mg/kg注射CTX进行免疫抑制。第15天，给注射NS-NS、CTX-NS组按0.5ml/只注射NS；NS-OVA、CTX-OVA组按0.5ml/只注射OVA-AL(OH)3进行加强免疫。（以上注射方法均以头颈部皮下三点注射0.25ml，腹部注射0.25ml。）NSNSNSOVACTXNSOVA图1小鼠分组示意图1.2.2细胞免疫功能检测（淋巴细胞转化试验）单细胞悬液的制备：小鼠摘眼球取血，室温放置2h后，离心分离血清，4℃保存备用。小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有3mlIMDM培养液的平皿内。将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入1.5mlEP管中，做好标记。细胞计数：分别取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20µl加到EP管中，加入980µl计数液，混匀后在显微镜下计数。调细胞浓度至1×107/ml，所需量为1ml。设原细胞浓度为X，需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：X/ml×Aml=1ml×1×107/ml计算出配比体积。在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。细胞培养：按图2所示在96孔培养板上加样，将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃5%C02培养箱中，培养48小时。MTT掺入：（48-72h后）：在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。每孔内加入MTT（5mg/ml)10µl，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。在37℃5%C02培养箱中继续培养2小时后，轻轻吸弃上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。加入100µl二甲亚砜（DMSO)，将颗粒溶解。结果测定：结果测量：用酶标仪测定光密度值A570nm（用空白孔调零），记录结果。结果判定：SI（刺激指数）=ConA刺激孔A值/对照孔A值。1-34-67-910-12Cspleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10µg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10µg/mlD

spleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10µg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10µg/mlEspleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10µg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10µg/mlF

spleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10µg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10µg/mlNSNS-NSNS-OVAACTX-NSCTX-OVA图2细胞培养加样示意图（所加细胞悬液、IMDM、ConA体积均为100µl）1.2.3体液免疫功能—B细胞功能检测1.2.3.1双向免疫扩散试验（检测抗OVA抗体）①标记：用玻璃笔在载玻片正面标记好小鼠所属组别。②制备琼脂凝胶：1.5%琼脂在微波炉内加热至完全溶解。③铺胶：将刻度吸管预热后，用刻度吸管吸取5ml琼脂加在载玻片表面，冷却15min后形成均匀的琼脂凝胶。④倍比稀释抗血清：取4个酶联管，做好标记；先加入生理盐水50ul/管；在第一管中加入50ul抗血清（为之前4℃冷藏的分离血清），混匀后吸出50ul加入第二管，依次类推，进行倍比稀释，稀释度依次为1:2，1:4，1:8及1:16。⑤打孔：待琼脂凝固后，按照打孔纸样打孔，每张载玻片打两组梅花孔。⑥加样：按图3所示加样，Ag和Ab每孔加满为止（将加样器头插入孔底，缓慢加入液体，直到孔满）。⑦孵育：放入湿盒，37℃扩散24小时。生理盐水1:1生理盐水1:1Ag(OVA0.1mg/ml）1:161:2待测血清（不同稀释度）1:81:4图3双向免疫扩散加样示意图1.2.3.2酶联免疫吸附试验（ELISA）①包被：用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA）稀释（10µg/ml)。100µl/孔加入聚苯乙烯酶标板中。②封闭：弃去孔内溶液，加入150µl/孔2%BSA（封闭液），43℃，60mins。③加样：弃去封闭液，按图4加倍比稀释的待测免疫血清100µl/孔，43℃孵育40mins；孵育结束后，用PBS-T洗液加满孔，每次3min，洗三次，在吸水纸上排干液体。④酶抗：酶标抗体(HRP-羊抗鼠IgG)，100µl/孔，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次3min，在吸水纸上排干液体。⑤显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100µl/孔，室温下避光显色。⑥终止：加50µl/孔2M硫酸(终止液)。⑦判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的最高抗体稀释度为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照孔A值相比其比值≥2，相对应的最高抗体稀释度为该抗体的效价。（操作中只采用了肉眼观察方法。）图4酶联免疫吸附试验加样示意图1.2.4吞噬细胞功能检测（小鼠腹腔巨噬细胞吞噬印度墨汁试验）实验前2天，给全部小鼠腹腔注射5％淀粉溶液1ml。颈椎脱臼处死小鼠，剪开小鼠腹部皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪开一小口，用1000µl加样器向腹腔打入2ml培养液，反复冲洗腹腔，吸出腹腔液放入EP管中。每组样品取1张载玻片，做好标记。分别加两滴100ul腹腔液，其中一滴加5ul墨汁，置湿盒中，37℃孵育1h。用生理盐水洗掉未贴壁细胞和墨汁，盖好盖玻片后，显微镜下观察，用40倍镜查找观察100个巨噬细胞，计数其中未吞噬墨汁的巨噬细胞数、吞噬了墨汁的巨噬细胞数，计算吞噬百分率。吞噬百分率:有吞噬作用的巨噬细胞数／100×100％。小鼠腹腔液小鼠腹腔液+印度墨汁小鼠腹腔液小鼠腹腔液+印度墨汁图5小鼠腹腔巨噬细胞吞噬印度墨汁试验加样示意图 结果2.1淋巴细胞转化试验结果用酶标仪测定96孔培养板光密度值A570nm（用空白孔调零），记录结果并计算刺激指数，SI（刺激指数）=ConA刺激孔A值/对照孔A值，所得结果如表1所示。由所得数据计算平均值得：脾淋巴细胞：SI（NS-NS）为=average(B3:B6)1.32125，SI(NS-CTX)为=average(C3:C6)0.97275，SI(NS-OVA)为=average(D3:D6)1.3885，SI(CTX-OVA)为=average(E3:E6)1.05525；胸腺淋巴细胞：SI（NS-NS）为=average(F3:F6)1.11825，SI(NS-CTX)为=average(G3:G6)0.9845，SI(NS-OVA)为=average(H3:H6)1.13875，SI(CTX-OVA)为=average(I3:I6)1.02225。由数据结果可得，抑制组的抑制效果虽然不好但是与对照组相比值明显小了，说明CTX对淋巴细胞功能有抑制作用。SpleenThymusNS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVANS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA11.7551.0431.6151.1751.1340.7441.2681.20821.020.951.451.011.0691.0631.0240.99631.230.961.241.151.1811.1211.1381.04441.2800.9381.2490.8861.0891.0101.1250.841平均值=average(B3:B6)1.32125=average(C3:C6)0.97275=average(D3:D6)1.3885=average(E3:E6)1.05525=average(F3:F6)1.11825=average(G3:G6)0.9845=average(H3:H6)1.13875=average(I3:I6)1.02225表1淋巴细胞转化试验结果2.2体液免疫功能检测2.2.1双向免疫试验结果抗原抗体在琼脂凝胶中湿盒37℃扩散48h后检查结果，结果如表2，NS-NS组、NS-CTX组结果均为阴性，NS-OVA组最高稀释倍数为1:16，而CTX-OVA组出现两个阳性数据，与理论结果不符，说明免疫抑制模型建立为成功，但从所得数据结果可知免疫功能减弱。NS-OVA组结果如图6所示。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA1阴性阴性1:16阴性2阴性阴性1:41:23阴性阴性1:81:14阴性阴性1:8阴性表2双向免疫扩散结果NS1:1NS1:11:161:21:161:21:81:41:81:4NS-OVACTX-OVA图6组1双向免疫扩散结果示意图2.2.2酶联免疫吸附实验结果酶标板显色结果如表3所示仅两个数据组有抑制效应，但并不理想。而从抗体效价的数据看，各组稀释倍数均较高，说明各对照组实验较成功。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA11:160阴性1:20480阴性2阴性1:1601:819201:128031:6401:6401:102401:16041:12801:801:20480阴性表3酶联免疫吸附试验结果2.3吞噬细胞功能检测显微镜下观察结果，计数并计算吞噬细胞吞噬率所得结果如表5所示，虽然有几组异常数据，且抑制组数据结果也提示一直模型没有建立成功，但由平均值可以看出与对照组相比，抑制组的巨噬细胞吞噬百分比显然低，可以说明虽然没有得到抑制效果，但是巨噬细胞功能被明显减弱。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA1100%100%无细胞0265%50%59%53%331%8%25%23%476%35%72%43%平均值=average(B2:B5)68%=average(C2:C5)48.25%=average(D3:D5)52%=average(E2:E5)29.75%表4吞噬细胞功能检测结果3.讨论环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，已有大量研究表明其能抑制动物的体液和细胞免疫应答，造成动物的免疫抑制[2-4]。构建免疫抑制模型时，环磷酰胺可抑制各种动物的体液与细胞免疫应答，机体免疫功能下降可表现在诸多方面[5]。本实验利用其免疫抑制作用多小鼠进行免疫抑制建立免疫抑制模型，并通过对淋巴细胞功能、体液免疫功能及吞噬细胞功能的检测来检验免疫抑制模型的建立是否成功。有研究表明，环磷酰胺可引起小鼠脾T淋巴细胞和B淋巴细胞增值能力下降[6]。本实验中淋巴细胞转化试验结果显示抑制组脾淋巴细胞的刺激指数小于对照组，提示环磷酰胺对脾淋巴细胞的增殖有抑制作用，结果与研究相符，且胸腺中抑制组淋巴细胞的刺激指数也小于对照组，共同提示淋巴细胞的增值能力被抑制。由体液免疫功能的检测结果可得虽然在抑制组中仍可检测到抗体效价，但与对照组相比较，可检测到的抗体稀释倍数远小于对照组，提示B细胞增殖被抑制，产生抗体的能力降低。因此环磷酰胺对小鼠淋巴细胞确有毒性作用，可抑制其增殖。虽此次实验的抑制模型未建立成功，但证实了环磷酰胺对免疫功能有抑制作用。有实验证明，以20mg/kg体重的CP每日给荷瘤鼠，连续7次，巨噬细胞吞噬率和吞噬指数没有明显变化[7],本实验中小鼠腹腔巨噬细胞功能检测结果中，抑制组小鼠巨噬细胞的吞噬百分比明显低于对照组，且有数据表明吞噬百分比为0，提示巨噬细胞功能降低，此结果与相关研究相符。此次试验的免疫抑制模型岁构建不成功，但是仍从各细胞免疫功能、体液免疫功能及固有免疫功能三个方面证实了环磷酰胺对免疫系统具有抑制作用。对于此次试验失败的原因，可能有几点原因，一是实验规模有限，数据不具有统计意义；二是操作不够严格规范，过程中可能有污染，丢失等造成实验结果与理论结果偏离；三是由于条件有限，各实验仪器、试剂等规格不够精确，造成实验测量、本身反应等有误差，造成实验结果的不符。本次实验虽未能成功建立小鼠免疫抑制模型，但在一定程度上证实了环磷酰胺对小鼠免疫功能起到了一定抑制作用。4.参考文献：[1]PELAEZB,CAMPILLOJA,LOPEZ一ASENJOJA,etal.Cyclophosphamideinduces