第二章-核酸化学-3-(2)课件

第三节核酸的理化性质与应用一、两性电解质二、高分子性质三、UV吸收260nm四、变性、复性与分子杂交五、核酸性质的应用

一、两性电解质1.

两性电解质\但酸性强

电泳行为---向正极移动（pH7-8），移动速率与分子大小、凝胶浓度、电流强度有关。

2.DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液，RNA可溶；DNA溶于1mol/L的NaCl溶液，而RNA则不溶；

3.蛋白质的去除：加入SDS、高温变性、有机溶剂（氯仿＋异戊醇）变性、柠檬酸、高氯酸等。用高氯酸除去磷蛋白、糖类、磷脂、核苷酸类辅酶和游离核苷酸、酸溶性小分子物质等杂质。4.DNA提取：不溶于一般有机溶剂，在乙醇中不溶形成沉淀。总RNA电泳图DNA电泳图二、高分子性质

粘度DNA>RNA超离心沉降凝胶过滤（电泳）三、UV吸收260nm嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，在紫外波段具有强烈吸收，最大吸收值在260nm附近。核酸的UV吸收的应用核酸浓度的测定双链DNA：A260表示样品的260nm吸收值为0.01，核酸的浓度为500ng/ml。A260×（稀释倍数）×50ug/mlRNA：A260×（稀释倍数）×40ug/ml单链DNA：A260×（稀释倍数）×33ug/ml寡核苷酸：

A260×稀释倍数×20ug/ml1％核酸的纯度A260/A280

DNA：比值1.8左右比值＞1.9,表明有RNA污染比值＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染RNA：比值为1.8-2.0比值＜1.7，表明有蛋白质或酚污染比值＞2.0，表明可能有异硫氰酸残存（一）变性(denaturation)核酸在理、化因素作用下，双螺旋结构破坏变成单链，但不涉及共价键的断裂称核酸变性。与降解的区别？引起的因素：化学因素：酸碱变性、尿素、甲醛变性物理因素：热变性DNA的热变性更具典型意义

四、变性、复性与分子杂交DNA的热变性特点：生物活性部分或完全丧失粘度改变，线性分子变得无序，粘度下降UV吸收增强DNA的热变性是指DNA分子在加热条件下由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。

增色效应与减色效应核酸变性后,氢键破坏，双螺旋结构破坏，碱基暴露，紫外吸收（260nm）增强，谓增色效应减色效应：核酸的光吸收值比其各核酸成分的光吸收值之和少，这是由于碱基有规律地堆积在一起造成的。

熔点\熔解温度(Tm)热变性过程中光吸收达到最大吸收值（完全变性）的50%时的温度，称Tm8090100100%50%A260

Tm

变性温度范围①②③℃Tm值大小与DNA的结构相关:DNA(G+C)含量有关，G+C含量愈大，Tm愈高与核酸分子的均一性有关，均一性愈强，Tm愈低。与介质离子强度成正比DNA发生热变性后，经缓慢降温，如放置室温逐渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成氢键，恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复性。核酸复性时对UV的吸收下降，发生减色效应（二）DNA的复性(renaturation)退火：DNA热变性后缓慢冷却恢复成双螺旋结构的过程。

DNA加热变性后，若经骤然降温，互补链碱基之间来不及配对互补，两链维持分离状态。慢骤

（三）核酸分子杂交hybridization

当不同来源的核酸变性后一起复性时，只要这些核酸分子中含有相同序列的片段，即可形成碱基配对，出现复性现象，形成杂种核酸分子，或称杂化双链，称核酸分子杂交。DNA-DNASouthernblottingDNA-RNANorthernblotting五、核酸性质的应用（了解）一核酸杂交与基因芯片技术二DNA的体外扩增（PCR技术）一核酸杂交与基因芯片二DNA的测序双脱氧DNA链合成终止法（DNA一代测序技术）原理:DNA的合成过程中，在新合成的DNA链的3

末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3

，5

-磷酸二酯键，逐一接入相应的核苷酸。如果DNA合成反应只使用一种引物，那么新合成的任何DNA链的起点都一样。如果接入的核苷酸不是一般的脱氧核苷酸，而是2

，3

-双脱氧核苷酸时，由于该核苷酸的3

碳位不含羟基，不能够再生成新的3

，5

-磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。5´端3´端CGA1.多聚核苷酸的连接(3’,5’磷酸二脂键）

Fig.DNAsequencingbySanger(dideoxy)method第二代DNA测序技术（主流）第二代测序技术靠的是连接测序，或者合成测序，包括焦磷酸测序和可逆性的链终止法。由罗氏(Roche)，以鲁米那(Illumina),赫利克斯(Helicos)和生命技术公司(LifeTechnologies)以商业化提供的仪器，以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式，每周输出数十亿碱基对(Gbp)的DNA序列。第三代DNA测序技术（研发中）第三代测序技术也叫从头测序技术（denovosequence），即单分子实时DNA测序。脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。三DNA的体外扩增

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR)所需条件：DNA模板dNTPs引物（Primer）DNA聚合酶反应体系（bufferwithMg2+）过程：变性退火延伸变性退火延伸……….第1章绪论本章重点和难点：生物化学的定义和学习生化的意义。小结第2章核酸化学本章和难点：重点是DNA、RNA的结构和性质；难点是DNA的二级结构。2.1核酸的种类和化学组成（掌握）DNA,RNA（tRNA,rRNA,mRNA）分布DNA

RNA

细胞核（%）98<10细胞质（%）2>90三种主要RNA的比较tRNArRNAmRNA总量10-15%80%~5%数量多少（3－4）最多功能运输氨基酸，具有反密码子蛋白质合成场所蛋白质合成模板，具有密码子核酸的化学组成磷酸核苷（nucleoside)戊糖-ribose(R)deoxyribose(dR)

碱基AGUCAGTC

核酸——多聚核苷酸（polynucleotides)n×核苷酸（nucleotide)基本结构单位——核苷酸2.2核酸的结构（掌握）核酸的一级结构:DNA或RNA分子中核苷酸的排列顺序与连接方式。核苷酸之间以磷酸二酯键连接形成多核苷酸链。DNA的二级结构(DNA双螺旋结构）重点理论基础：DNA的碱基组成（1952年Chargaff法则）[A]=[T]、[G]=[C][A]+[G]=[T]+[C]DNA双螺旋结构特点：1)DNA双螺旋是反平行双链右手螺旋，螺旋直径为2nm。2)两条链之间通过A/T,G/C互补配对的氢键相连。3)碱基平面与螺旋轴垂直,磷酸与脱氧核糖为DNA的骨架。4)相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。5）形成相间的大沟(majorgroove)及小沟(minorgroove)维持DNA双螺旋结构的稳定因素（1）碱基间氢键（2）碱基堆积力是使DNA结构稳定的主要因素（3）磷酸基与介质阳离子间的离子键（4）碱基分子内能碱基堆积力：由同一条核酸链中的相邻碱基之间的疏水作用力和范德华力构成DNA的高级结构DNA的超螺旋结构(superhelix或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。负超螺旋(negativesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反,即左手超螺旋(常见生物体状态).正超螺旋(positivesupercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同,即右手超螺旋(目前仅嗜热菌体内存在).

2.3RNA的结构（掌握）RNA的组成和结构特点：核糖核苷酸按一定顺序相连（3’，5’-磷酸二酯键）基本组成单位：AMP、GMP、CMP、UMP主要为单链mRNA的结构与功能：真核生物中：功能：合成蛋白质的模板结构特点：原核生物结构简单，可直接参与蛋白质合成2.3’尾巴：polyA尾巴（AAAAAAAAAAAAA）3.前体为hnRNA,具有编码区、非编码区1.5’帽子：m7GpppNtRNA的结构与功能：

功能：转运氨基酸至蛋白质合成场所结构特点：1.由70－90个核苷酸组成2.含10~20%的稀有或修饰核苷（DHU，假尿嘧啶，mG，mA）3.二级结构为三叶草形4.含有四个臂和四个环5.3’端为CCA-OH结构，为接受AA的部位6.反密码子环含有反密码子7.三级结构为倒L型。rRNA的结构与功能：21种原核真核小亚基rRNA蛋白质rRNA蛋白质大亚基16S18S33种5S，23S5S，5.8S，28S49种34种大小30S40S大小50S60S核糖体大小70S80SrRNA+蛋白质核糖体

核糖体的组成（蛋白质合成的场所）2.4核酸的理化性质（掌握）

一、两性电解质1.

两性电解质\但酸性强

电泳行为---向正极移动（pH7-8），移动速率与分子大小、凝胶浓度、电流强度有关2.DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液，RNA可溶；DNA溶于1mol/L的NaCl溶液，而RNA则不溶；3.DNA提取：DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，都溶于水，不溶于一般有机溶剂，在乙醇中不溶形成沉淀。二、高分子性质DNA分子由于直径小而长度大，因此粘度DNA>RNA超离心沉降，可以测定核酸的沉降常数和相对分子质量凝胶电泳可以分离大小不同的核酸分子三、核酸的紫外吸收性质嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，在紫外波段具有强烈吸收，最大吸收值在260nm附近。核酸浓度的测定双链DNA：A260表示样品的260nm吸收值为0.01，核酸的浓度为500ng/ml。A260×（稀释倍数）×50ug/mlRNA：A260×（稀释倍数）×40ug/ml单链DNA：A260×（稀释倍数）×33ug/ml寡核苷酸：

A260×（稀释倍数）×20ug/ml1％核酸的纯度A260/A280

DNA：比值1.8左右比值＞1.9,表明有RNA污染比值＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染RNA：比值为1.8-2.0比值＜1.7，表明有蛋白质或酚污染比值＞2.0，表明可能有异硫氰酸残存（一）变性(denaturation)核酸在理、化因素作用下，双螺旋结构破坏变成单链，但不涉及共价键的断裂称核酸变性。

四、变性、复性与分子杂交DNA的热变性是指DNA分子在加热条件下由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。

增色效应与减色效应核酸变性后,氢键破坏，双螺旋结构破坏，碱基暴露，紫外吸收（260nm）增强，谓增色效应减色效应：核酸的光吸收值比其各核酸成分的光吸收值之和少，这是由于碱基有规律地堆积在一起造成的。

熔点\熔解温度(Tm)热变性过程中光吸收达到最大吸收值（完全变性）的50%时的温度，称Tm8090100100%50%A260

Tm

变性温度范围①②③℃Tm值大小与DNA的结构相关:DNA(G+C)含量有关，G+C含量愈大，Tm愈高与核酸分子的均一性有关，均一性愈强，Tm愈低。与介质离子强度成正比DNA发生热变性后，经缓慢降温，如放置室温逐渐冷却，解开的互补链之间对应的碱基对再形成氢键，恢复完整的双螺旋结构，称DNA热变性的复性。核酸复性时对