western-blot-生化实验二课件

生化实验ⅡWestern-Blot检测14-3-3-HisTag融合蛋白表达．Western免疫印迹（WesternBlot）:

Western免疫印迹（WesternBlot）是利用电泳分离不同的蛋白组分后，将蛋白质转移到固相支持物（膜）上，然后利用特异性抗体检测目的蛋白的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。一、Westernblot介绍这个名称的由来：是1975年由英国人EdwinSouthern发明了Southernblot技术。随后美国斯坦福大学的GeorgeStark创建了检测RNA的Northernblot技术；1981年NealBurnette所著的《AnalyticalBiochemistry》中首次使用WesternBlot。ThemethodoriginatedinthelaboratoryofHarryTowbinatthe

FriedrichMiescherInstitute.Thename

westernblot

wasgiventothetechniquebyW.NealBurnette

andisaplayonthename

Southernblot,atechniquefor

DNA

detectiondevelopedearlierby

EdwinSouthern.DetectionofRNAistermed

northernblot

andwasdevelopedbyGeorgeStarkat

Stanford.SirEdwinSouthernBorn7June1938NationalityBritishFieldsBiochemistryInstitutionsUniv.ofOxford

Univ.ofEdinburghKnown

forInventorofthe

Southernblot蛋白质经SDS分离后，转移到固相载体（如NC膜）上，NC膜以非共价键形式吸附蛋白。用蛋白溶液（如BSA或脱脂奶粉）封闭NC膜上剩余的疏水结合位点后，加入特异性抗体（一抗），NC膜上目的蛋白与一抗特异结合形成Ag-Ab复合物，洗去未结合的一抗后，加入带标记的二抗，二抗与一抗结合形成抗体复合物，加入标记物的底物溶液后，催化底物产生可见的区带，指示所要研究目的蛋白位置。Westernblot原理：

在WesternBlot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。Westernblot主要实验流程ECLX-胶片一抗孵育二抗孵育封闭试剂SDS转膜封闭抗体孵育显色检测23456

Nitrocellulose

PVDF蛋白提取1WesternBlot优点

高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应

1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的相互作用目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析1、蛋白电泳：SDS聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N

，N

—四甲基乙二胺(N，N，N

，N

-tetramethylethylenediamine，TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)1、Acrylamide(A)

：形成聚合物链2、Bisacrylamide(B)

：形成纵向架桥（cross-linkage）3、Ammoniumpersulphate(APS)

：产生自由基4、Tetramethylenediamine(TEMED)：加速剂

O∥(A)CH2=CH–C–NH2

OO∥∥(B)CH2=CH–C–NH–CH2–NH–C–CH=CH2

︱

CONH2CONH2CONH

︱︱︱–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH–

︱CONH︱CH2︱CONH

CONH2CONH2︱

︱︱–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH–

︱CONH︱APS,TEMED*Acr有神经毒性特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212连续系统电泳体系：相同孔径的凝胶、缓冲系统等进行电泳，缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应，简单快捷。不连续系统：使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。四个不连续性：凝胶浓度的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不连续性；电位梯度的不连续性。PAGE：连续系统和不连续系统

作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸系统。（1）浓缩效应：浓缩胶（大孔胶）浓缩胶缓冲液pH6.8Tris-HCl,

电极缓冲液pH8.3Tris-Gly解离度：

Cl>

蛋>

Gly

mcl

cl>m蛋

蛋>mGly

Gly有效迁移率=m

，m为迁移率，

为解离度凝胶中Cl－为快离子，Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。

缓冲液样品浓缩胶分离胶浓缩效应：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3)蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。

缓冲液

浓缩胶

样品

分离胶浓缩效应示意图（2）分子筛效应：蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大(pH8.9Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。由于各种蛋白质分子量不同，有效迁移率不同，形成不同区带。

缓冲液浓缩胶分离胶十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS)是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体（monomer）和分子团的混合形式存在。作用：（1）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。（2）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。（3）与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。（3）电荷效应SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）：

（一）蛋白质分子的解聚样品和聚丙烯酰胺中加入阴离子去污剂SDS和强还原剂后，蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白-SDS复合物。蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。（1）SDS：它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。

（2）强还原剂巯基乙醇（β-mercaptoethanal）二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）

使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。

蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子SDS和还原剂的作用：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒

（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比蛋白质在SDS系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，蛋白质分子的迁移速度仅取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。影响SDS的关键因素（1）溶液中SDS单体浓度

大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1：1.4（2）样品缓冲液的离子强度

低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。（3）二硫键是否完全被还原

当二硫键被彻底还原后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。1.SDS2.

-mercaptoethanol(还原剂，使蛋白质二硫键断裂)3.bromophenolblue(小分子指示剂)4.Glycerol（增加溶液的比重）loadingbuffer2、样品处理ssSHSH沸水浴中5-10分鐘loadingbuffer仪器、材料垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子垂直电泳仪金属浴微量移液器凝胶成像系统6.半干电转槽试剂1、SDS试剂:10%SDS、30％丙烯酰胺、1.5mol/LpH8.8Tris－HCl缓冲液、0.5mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液、10%过硫酸铵、TEMED、pH8.3Tris-Gly电极缓冲液2、TBS缓冲液（10×）：Tris24.23g；NaCl80.06g溶于去离子水中，定容至1L。

3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、TBS-T缓冲液（1×）：10×TBS缓冲液100mL，ddH2O900mL，Tween-201mL，混合均匀，室温保存。。

5、封闭液:含5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液,脱脂奶粉5g溶于100ml的TBS-T缓冲液中。

6、显色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2021.0μl。

7、一抗：Anti-His-TagMouseIgG1；二抗：GoatAnti-MouseIgG-HRP。实验过程：

1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在支架上固定好.

※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀.

2.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入,大约为矮玻璃板2/3-3/4左右,之后在胶液上层轻柔加少许蒸馏水,静置30-40min.

※凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.

※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.

凝胶配制灌制分离胶隔绝空气ddH2O0.1%SDS:<8%异丁醇：>8%3.倒出水，用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置30-40min.

※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.4.将制好的凝胶在支架上夹好，放入电泳槽内，在槽内外层加入电泳缓冲液,内层要没过矮玻璃板上缘。拔出样梳。

※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

5、加样（1）10µl标准蛋白分子量marker。

（2）取蛋白样品，加入50µlH2O后，再加入50µl2倍样品缓冲液，混匀，沸水中加热5分钟，离心10000rpm，5min。

6.取20µl上清，加样。

※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.

灌制积层胶插入梳子7、接通电源，进行电泳，开始电压恒定在80-100V，当进入分离胶后改为120-140V，溴酚蓝距边缘5mm时，停止电泳。8、凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶放在大培养皿内，9、染色：加入染色液，染色1-2小时左右。10、脱色：染色后的凝胶用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。

※剥胶时要小心,保持胶完好无损.上样及电泳电泳条件：推荐：浓缩胶80-100V35——45min

分离胶120-140V45——75min3、转膜：要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。半干转湿转半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白方法仪器特点（1）半干式转膜：电泳毕，切除浓缩胶，在分离胶左上切角作标记，将凝胶浸入电转液中平衡1min。（2）剪取与分离胶大小相同的PVDF膜和6张滤纸，自下而上依次叠放滤纸（6层）、膜、凝胶、滤纸（6层）。放置在半干转仪阳极板上。（3）盖上带阴极板的上盖。以8mA/cm2电流转印70-90min，将蛋白转至PVDF膜上。注：（1）PVDF膜使用前先在甲醇中浸透（≤15秒），后取出浸入电转液中5-10min。（2）每步都要赶除气泡转膜：转移膜的选择：最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。NC膜PVDF膜材质特点韧性较差，易损坏机械强度高蛋白结合能力80-150ug/cm2125-200ug/cm2是否用甲醇处理不需要需要适用范围0.45um＞20KD蛋白0.2um＜20KD蛋白0.45um一般蛋白0.2um小于20KD蛋白

染膜丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色

只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。染胶考马斯亮蓝对凝胶染色考马斯亮蓝（coomassiebrilliantblue）

①R-250：三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。

转膜后检测（此步可以省略）4、封闭：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。方法：将膜从电转槽中取出，去