高效液相色谱化学发光检测法

高效液相色谱化学发光检测法一.概述

高效液相色谱是一种非常有效的分离手段。它已被广泛用于各种复杂混合物的分离和定量分析。高效液相色谱所用的检测器可分为以下几类：

1.紫外-可见（UV-VIS）Detector（选择性）

2.荧光（FL）Detector（选择性）

3.化学发光（CL）Detector（选择性）

4.示差折光检测器（通用）每一种物质都有不同的折射选择性

5.电化学检测器

6.放射性检测器选择性

化学发光分析具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单的优点，但选择性较差。而高效液相色谱是非常有效的分离手段，将两者联用，可克服化学发光分析选择性差的缺点。而化学发光检测器又为高效液相色谱提供了高灵敏度的检测手段。安培法选择性电导法通用2．仪器

ＰｕｍｐＰｕｍｐＰｕｍｐMobilephaseLCcolumnCLreagentsmixerObservationcellwasteinject3.CL检测法需要考虑的问题化学发光反应必须对某类物质响应,如果仅与某一种物质有关,在HPLC中将有限制的应用。化学发光强度对各种环境因素是敏感的.如温度、溶剂、离子强度、pH和其它物质的存在。在发展HPLC分离操作时，这些因素也须加以控制。因此，分离条件和探测条件可能是不兼容的或两者须相互妥协。化学发光反应的发射强度不是常数，而是随时间而变化。发射强度ICL随时间衰变曲线不同的CL反应，有不同的衰变曲线。即使同一反应，在不同的条件其衰变曲线也不同。

在流动体系中，整个发射强度随时间的衰变曲线将不被观察，被探测的ICL是反应物流经检测池所需时间间隔内对发光强度的积分。在流动体系中，t由流速和池体积所控制，若V不变，通过调节流速和流路的设计使Imax与时间窗口相吻合。如下图：ICLICLttLucigeninLuminolcellABICLflowtime二.过氧草酸酯化学发光反应

在HPLC中的应用1.荧光分析物的测定多环芳烃（PAHS）

polycyclicaromatichydrocarbons

氨基多环芳烃（Amino-PAHS）蒽、芘、苯并芘、氨基蒽、氨基芘2.荧光衍生分析物的测定一些分析物本身没有荧光，因此必须进行荧光衍生反应，一般衍生在柱前完成。(1)丹磺酰氯及其衍生物

丹磺酰氯是一种非常灵敏的荧光标记

试剂，它的分子体积小，已广泛采用。主要用于伯、仲胺和酚羟基化合物。如氨基酸、儿茶酚胺、甾二醇以及某些化合物。（2）衍生物丹磺酰氯的各种衍生物已经被合成，如下：

丹磺酰氯可用来衍生羰基化合物，如醛、酮

酮基皮质甾类、氧代甾族化合物和胆质酸。（3）其它衍生物试剂荧光胺已用于衍生儿茶酚胺。香豆素类试剂可用于衍生含羰基的羧酸、前列腺素、胺和氟代嘧啶类化合物。3.检测由酶反应产生的过氧化氢

酶反应产生的过氧化氢在过量的荧光物质存在下可由PO-CL测定。此反应可在pH=7完成，接近大多数的酶反应的pH，这是利用PO-CL测定H2O2优于Luminol、光泽精之处。L-aminoacid+H2O+O22-oxoacid+NH3+H2O2L-aminoacidoxidaseD-glucose+H2O+O2gluconicacid+H2O2

Acetylcholineacetate+cholineCholinebetaine+H2O2GlucoseoxidaseacetylcholinesteraseCholineoxidose乙酰胆碱胆碱

这种柱后反应器一般采用固态酶反应器。AnalyteEnzymeDetectionlimitCholesterolLactoseFormaldehydeL-AminoacidCholesteroloxidase半乳糖甙酶β-GalactosidaseAldehydeoxidaseL-aminoacidoxidase0.1pmol12ng1pmol2pmolAnalyteEnzymeDetectionlimitAcetylcholineGlucoseL-Aminoacidspolyamines胆碱酯酶GlucoseoxidaseL-AminoacidoxidasePolyaminesoxidase1pmol2pmol1pmol5pmol4.检测能熄灭过氧草酸酯化学发光的物质

过氧草酸酯的化学发光反应可被某些物质熄灭，使发光强度大大降低。基于此原理，已研究过HPLC-熄灭化学发光检测器，可用于溴化物、碘化物、硫化物、亚硫酸盐、苯胺类及某些有机硫化合物。

PO-CLdetectionofhydrogenperoxideproducedbyenzymaticreactionPO-CL的特点：1.与荧光检测法相比，PO-CL检测通常可使灵敏度提高30-100%，在酶参加的反应中该方法的选择性也大为提高。2.与激光诱导的荧光检测法相比，PO-CL对衍生试剂有较宽的选择范围，而LIF仪器价格昂贵。

三.LuminolCL体系在HPLC中的应用1.催化剂（1）金属离子的测定金属离子可催化LuminolCL，因此，金属离子用离子交换柱分离后，可用LuminolCL测定。如：Cu2+、Co2+、Ni2+

（2）利用抑制剂对LuminolCL产生抑制作用。a.氨基酸b.药物（儿茶酚胺、氨基糖苷抗菌素、庆大霉素Cc.蛋白质（球蛋白、白蛋白）2.卷入H2O2的测定利用分析物定量转化为H2O2，主要用于光氧化的CL体系中。如脂肪族的含氧化合物：醇、醚、醛、糖类，经HPLC分离后，经光氧化器产生H2O2，可用Co2+催化的LuminolCL体系测定。3.用Luminol作为标记试剂

Luminolisoluminol和aminobutylehyliso-luminol通过-NH2与分析物反应，测定luminol及衍生物的浓度已用于羧酸、胺、甲基睾酮、氨基酸、核苷、地谷新、人血清中脱氧麻黄碱等的测定。四、Lucigenin在HPLC中的应用利用血液及尿液中有机还原剂（还原性糖、抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、尿酸等）与光泽精的化学发光反应。通过HPLC分离后，用光泽精体系检测这些还原性物质。五、生物发光反应在HPLC中的应用

可测ATP、胆酸、肌醇磷酸酯异构体六、

其它化学发光反应在HPLC中的应用（1）钌试剂CL

钌试剂和还原剂作用可产生CL，发现脂肪胺与试剂反应产生CL的次序：叔胺>仲胺>伯胺，芳香胺几乎不发生反应。钌试剂作为柱后CL衍生试剂，用于脂肪叔胺的HPLCCL检测，该检测系统也曾用于抗生素、氨基酸、肽和蛋白质的