中药指纹图谱研究技术专家讲座

内容一、中药指纹图谱技术概述二、中药指纹图谱研究指导标准三、指纹图谱研究相同度计算四、中药指纹图谱研究方法与思绪五、中药指纹图谱研究示例演示（试验）中药指纹图谱研究技术专家讲座第1页一、中药指纹图谱技术概述中药指纹图谱研究技术专家讲座第2页（一）中药指纹图谱与中药质量（二）中药指纹图谱研究方法学（三）中药指纹图谱技术发展中药指纹图谱研究技术专家讲座第3页指纹图谱稳定性可控性安全性有效性1.中药指纹图谱与中药安全、有效、稳定关系（一）中药指纹图谱与中药质量中药指纹图谱研究技术专家讲座第4页2.国内中药质量评价现实状况植物学方法： 原植物判定，显微判定等植物化学方法： 理化判定分析化学方法： 仪器分析，色谱分析等药理学方法： 生物判定法，生物等效等分子生物学方法: DNA指纹判定中药指纹图谱研究技术专家讲座第5页3.国外植物药质量评价概况标准制剂： 银杏人参西洋参五味子 甘草黄芪贯叶连翘 定量测定结合主成份百分比固定产地以生产质量恒定制剂各种分析伎俩和方法包含药材、中间体等指纹图谱中药指纹图谱研究技术专家讲座第6页4.中药指纹图谱意义

是全方面反应中药所含内在化学成份种类与数量，进而反应中药质量，尤其在现阶段中药有效成份绝大多数没有明确，采取中药指纹图谱方式，将有效地表征中药质量和稳定性有利于中药及其产品进入国际市场中药指纹图谱研究技术专家讲座第7页5.中药指纹图谱建立标准

系统性：指纹图谱所反应化学成份，应包含中药有效部位所含大部成份种类，或指标成份全部特征性：指纹图谱中反应化学成份信息（详细表现为保留时间或位移值）是含有高度选择性，是这些信息综合结果稳定性：指纹图谱在要求方法与条件下应能作出相对一致指纹图谱

色谱特征稳定性：特征峰 特征区 特征参数色谱条件稳定性：不一样仪器验证 不一样试验室验证不一样操作者验证中药指纹图谱研究技术专家讲座第8页☆品种判别--真伪☆基源判别--产地☆药用部位判别--根、茎、叶、花、果☆提取工艺☆药材炮制☆限量成份控制☆一致性--不一样批次产品.6.指纹图谱研究目标中药指纹图谱研究技术专家讲座第9页

品种多、产地多;采收、加工不一致

－化学组分与含量不一样 （产品品质优劣不一样）有效组分种类繁多、含量相对少；非有效组分成分复杂、含量高 －分析检测困难 （质量控制指标不统一）基础研究微弱药材GAP建设滞后7.建立中药指纹谱所面临问题中药指纹图谱研究技术专家讲座第10页8.对策加强GAP药材种植基地建设加强中药种植与加工、炮制规范化加强中药化学成份基础研究应用当代分析技术伎俩进行中药指纹图谱研究中药指纹图谱研究技术专家讲座第11页仪器设备技术人员研究经验系统性问题稳定性问题特征性问题9.中药指纹谱研究过程中面临问题中药指纹图谱研究技术专家讲座第12页色谱法

1.液相色谱法（LC） 2.气相色谱法（GC） 3.薄层扫描法（TLC） 4.毛细管电泳法（CE）其它

1.质谱法（MS）及色谱与质谱联用 2.X-衍射法 3.近红外法（NIR）等（二）中药指纹图谱研究方法学中药指纹图谱研究技术专家讲座第13页（三）中药指纹图谱技术发展应用范围仪器设备与软件指纹图谱标准中药指纹图谱研究技术专家讲座第14页二、中药指纹图谱研究指导标准中药指纹图谱研究技术专家讲座第15页（一）目标和要求（二）中药指纹图谱标准起草说明（三）中药指纹图谱标准建立中药指纹图谱研究技术专家讲座第16页中药质量研究和质量标准一个主要内容加强中药质量管理、提升中药质量、确保药品安全、有效、稳定、可控固定原料药（中药材）品种、产地和采收季节前提下，需制订原料药(中药材)和注射剂指纹图谱（一）目标和要求中药指纹图谱研究技术专家讲座第17页（二）中药指纹图谱标准起草说明1.名称、汉语拼音2.起源（产地、采收期、炮制）按中药命名标准制订药材：产地、采收期、炮制中间体：提取工艺或提取物起源中药指纹图谱研究技术专家讲座第18页3.供试品溶液制备

有效成份(专属性成份、指标性成份)理化性投质并结合检测方法要求提取工艺参考物溶液制备 对照品内标物标准提取物

中药指纹图谱研究技术专家讲座第19页中药指纹图谱检测方法验证（1）检测方法测定方法、仪器、试剂、测定条件（2）验证专属性（空白试验）精密度试验（RSD<3%） 重复性与重现性试验（S<0.95）稳定性试验（S<0.95）系统适应性试验6.指纹图谱相关性中药指纹图谱研究技术专家讲座第20页（三）中药指纹图谱标准建立中药指纹图谱研究技术专家讲座第21页注意事项

（1）全部成份应在2小时左右洗脱，并提供2小时指纹图谱（2）可建立各个组分指纹图谱（3）可建立各种方法指纹图谱（4）可选择经典样品指纹图谱，或标准提取物指纹图谱，或含有代表性勾兑样品指纹图谱作为标准指纹图谱中药指纹图谱研究技术专家讲座第22页2.指纹图谱标准建立

（1）药材、中间体指纹图谱标准为企业内控标准，列入起草说明（2）10批供试品（3）标准要求：供试品指纹图谱与对照提取物（标准提取物指纹图谱一致；或供试品指纹图谱与对照指纹图谱（标准图谱）一致；或经过对各特征峰位置（相对保留时间、比移值等）、丰度（积分面积或峰高）及相对丰度、光谱特征（颜色）等综合参数描述给予确定。中药指纹图谱研究技术专家讲座第23页指纹图谱标准书写格式液相色谱法【指纹图谱】照高效液色谱法（中国药典一部附录VID），结合指纹图谱要求测定。色谱条件及系统适用性试验如以对照品做系统适用性试验，则参考中国药典书写格式。如以随行对照提取物做系统适用性试验，则只书写所用仪器、色谱柱型号及相关参数和各项详细试验条件。对照品溶液制备如有对照品则照中国药典书写格式。供试品溶液制备精密吸收供试品溶液、对照品溶液（或对照用提取物溶液）各XXml，分别流入液相色谱仪，测定。本品指纹图谱主要特征供试品指纹图谱与质量标准所附对照指纹图谱（或随行对照提取物指纹图谱）经计算软件计算，相同度大于XX，符合要求（或相同度小于XX，不符合要求）。中药指纹图谱研究技术专家讲座第24页三、指纹图谱研究相同度计算中药指纹图谱研究技术专家讲座第25页（一）、指纹图谱相同度评价标准与方法（二）、指纹图谱相同度计算原理（三）、指纹图谱相同度评价软件中药指纹图谱研究技术专家讲座第26页（一）、指纹图谱相同度评价标准与方法标准：整体性、含糊性、特征性方法：直接观察、计算机辅助相同性计算中药指纹图谱研究技术专家讲座第27页1.引用参数2.数据获取路径3.相同度算法（二）、指纹图谱相同度计算原理中药指纹图谱研究技术专家讲座第28页1.引用参数①保留时间(RT)②峰高(Height)③峰面积(Area)④峰面积百分比（Area%）⑤相对保留时间（RatioofRetentionTime,RRt）⑥积分相对比值（RatioofArea,RA）中药指纹图谱研究技术专家讲座第29页2.数据获取途径（1）图形/图像转化成ASCII数据（2）截片数据（3）色谱数据

中药指纹图谱研究技术专家讲座第30页3.相似度算法

夹角余弦算法 相关系数算法优化算法中药指纹图谱研究技术专家讲座第31页1.软件开发标准2.市售/惯用软件介绍3.相同度软件使用过程中应注意问题（三）、指纹图谱相同度评价软件中药指纹图谱研究技术专家讲座第32页1.软件开发原则系统独立性

(2)计算方法科学性

(3)数据接口通用性

(4)操作过程及应用实用性中药指纹图谱研究技术专家讲座第33页2.市售/惯用软件介绍浙江大学陈一宇教授中南大学梁逸增教授沈阳药科大学毕开顺教授西北大学李华教授二军大Waters中药指纹图谱研究技术专家讲座第34页3.相同度软件使用过程中应注意问题数据接口与数据类型数据校正算法选择中药指纹图谱研究技术专家讲座第35页四、中药指纹图谱研究方法与思绪中药指纹图谱研究技术专家讲座第36页（一）、研究方案设计（二）、样品选择与搜集（三）、供试品制备（四）、指纹图谱色谱条件研究思绪（五）、相同度值研究与指纹特征中药指纹图谱研究技术专家讲座第37页（一）、研究方案设计资料搜集与整理

文件、工艺资料、质量标准方案设计

（1）研究对象-有效成份（2）研究方法选择-色谱法(HPLCGCTLC)及其它方法（3）研究内容-依据技术要求要求：包含“名称、起源、制备、检测方法、标准要求及起草说明”中药指纹图谱研究技术专家讲座第38页（二）、样品选择与搜集要求： 10个批次道地药材与GAP基地药材经典性与代表性离散样品剔除中药指纹图谱研究技术专家讲座第39页（三）、供试品制备依据：有效组分物理化学性质生产或提取工艺检测方法需要中药指纹图谱研究技术专家讲座第40页（四）、指纹图谱色谱条件研究思绪高效液相色谱法HPLC气相色谱法GC中药指纹图谱研究技术专家讲座第41页（1）检测波长选择（简）（2）柱温选择（略）（3）进样量（简）（4）色谱柱选择（重点）（5）检测成份选择（重点）（6）流动相（梯度表）选择（重点）1.高效液相色谱法HPLC中药指纹图谱研究技术专家讲座第42页示例：蜂胶(BeePropolis)（1）检测波长选择中药指纹图谱研究技术专家讲座第43页

=280nm

=360nm

=254nm

=210nm中药指纹图谱研究技术专家讲座第44页波长选择：

=280nm中药指纹图谱研究技术专家讲座第45页（4）色谱柱选择

选取市场上较常见填料所填充色谱柱，比如：Eka-NobelKromasiC18(5mm)，其分离效果好、性能稳定，不论是国产填充Kromasi色谱柱，还是国外企业填充Kromasi色谱柱，在分离效果上基本相同。所以对于大多数中药注射剂，可选取Kromasi色谱柱。如选取乙腈-缓冲溶液，应依据缓冲溶液特点，选取对应色谱柱：①如为酸性缓冲溶液，可选取ZorbaxSB-C18色谱柱（pH<2）；②如为碱性缓冲溶液，可选取EclipseXDB-C18色谱柱（pH>6）。示例：不一样色谱柱对三七总皂苷分离效果中药指纹图谱研究技术专家讲座第46页Lichosorb中药指纹图谱研究技术专家讲座第47页Polaris中药指纹图谱研究技术专家讲座第48页Kromasil中药指纹图谱研究技术专家讲座第49页Diamonsil中药指纹图谱研究技术专家讲座第50页Carbosorb中药指纹图谱研究技术专家讲座第51页中药指纹图谱研究技术专家讲座第52页（5）检测成份选择（重点）示例：何首乌中药指纹图谱研究技术专家讲座第53页何首乌生品液相色谱图（全局图）中药指纹图谱研究技术专家讲座第54页何首乌生品液相色谱图（局部放大图）中药指纹图谱研究技术专家讲座第55页中药指纹图谱研究技术专家讲座第56页中药指纹图谱研究技术专家讲座第57页中药指纹图谱研究技术专家讲座第58页中药指纹图谱研究技术专家讲座第59页中药指纹图谱研究技术专家讲座第60页中药指纹图谱研究技术专家讲座第61页图9上海制首乌指纹图谱

北京良方药业制首乌

中药指纹图谱研究技术专家讲座第62页北京金象药店制首乌

北京寿春堂药店制首乌指纹图谱

中药指纹图谱研究技术专家讲座第63页（6）流动相（梯度表）选择主要影响原因1.起始浓度2.梯度速率3.流速中药指纹图谱研究技术专家讲座第64页时间∕min水%（H+/OH-）*乙腈%*Ⅰ

01000552080600100Ⅱ

01000407030606040Ⅲ

08020406040605050Ⅳ

06040403070600100*为体积百分比（V/V）

指纹图谱流动相梯度优化*

为体积百分比（V/V）

梯度表中药指纹图谱研究技术专家讲座第65页初始色谱条件时间（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000600100时间（min）水%（H+/OH-）乙腈%01000552080600100中药指纹图谱研究技术专家讲座第66页初始色谱条件设定依据及目标依据：化合物极性大小。如未知时，假设有效组分中包含各种极性成份。目标：快速确定主要或大部分化合物被洗脱时流动相组成，为优化条件选择提供依据。中药指纹图谱研究技术专家讲座第67页优化条件选择选择依据：初始色谱图、梯度洗脱表及一定经验示例：（1）淫羊藿总黄酮（40%）提取物 （2）钩藤总生物碱 （3）黄连药材 （4）知母总皂苷

中药指纹图谱研究技术专家讲座第68页淫羊藿提取物在初始条件下色谱图中药指纹图谱研究技术专家讲座第69页淫羊藿提取物第一次优化后色谱图中药指纹图谱研究技术专家讲座第70页梯度速率： 初始：100/60min=1.7/min 优化：0~1.7中药指纹图谱研究技术专家讲座第71页CH3CN%CH3CN%MinMin初始条件中药指纹图谱研究技术专家讲座第72页CH3CN%Min三七人参西洋参CH3CN%Min中药指纹图谱研究技术专家讲座第73页起始浓度：依据初始色谱图中主要色谱峰被洗脱时流动相组成，对应降低~20%。流速：0.5~2.0ml/min中药指纹图谱研究技术专家讲座第74页2.气相色谱法（1）影响色谱峰分离程度原因 色谱柱类型 载气流速 起始柱温 升温速率

中药指纹图谱研究技术专家讲座第75页（2）研究示例 样品：广藿香油指纹图谱研究过程

方案设计中药指纹图谱研究技术专家讲座第76页检测方法 （1）色谱方法 广藿香油为广藿香药材经水蒸汽蒸馏而得到挥发油，均为易挥发组分，拟采取气相色谱法（GC）。 （2）仪器：

Agilent6890GC （3）色谱柱选择 可供选择色谱柱：极性 非极性 中等极性 （4）进样方式确实定

手动自动顶空中药指纹图谱研究技术专家讲座第77页2.供试品溶液制备

取广藿香油适量，加醋酸乙酯溶解，即得。 注：对于非极性毛细管色谱柱，如供试品溶液中含少许少，最好干燥后进样。中药指纹图谱研究技术专家讲座第78页2.色谱条件探索（1）对梯度速率及流速进行微调-由粗到精

中药指纹图谱研究技术专家讲座第79页初始条件流速： 3.0 ml/min进样口温度： 250 ℃检测口温度： 280 ℃初始柱温： 50 ℃升温速率： 30 ℃/min中药指纹图谱研究技术专家讲座第80页第一次优化流速： 2.0 ml/min进样口温度： 250 ℃检测口温度： 280 ℃初始柱温： 50 ℃升温速率： 20 ℃/min中药指纹图谱研究技术专家讲座第81页第二次优化流速： 1.0 ml/min进样口温度： 250 ℃检测口温度： 280 ℃初始柱温： 50 ℃升温速率： 10 ℃/min中药指纹图谱研究技术专家讲座第82页第三次优化流速： 1.0 ml/min进样口温度： 250 ℃检测口温度： 280 ℃初始柱温： 50 ℃升温速率： 5 ℃/min中药指纹图谱研究技术专家讲座第83页第四次优化流速： 0.5 ml/min进样口温度： 250 ℃检测口温度： 280 ℃初始柱温： 50 ℃升温速率： 5 ℃/min中药指纹图谱研究技术专家讲座第84页（2）选择细化初始条件-由细到精中药指纹图谱研究技术专家讲座第85页初始条件流速： 1.0 ml/min进样口温度： 250 ℃检测口温度： 280 ℃初始柱温： 50 ℃升温速率： 1.0 ℃/min中药指纹图谱研究技术专家讲座第86页第一次优化流速：