microRNA研究专题知识专家讲座

microRNA——Smallmolecular,BigworldmicroRNA研究专题知识专家讲座第1页microRNA发觉与研究历史microRNA——年《science》十大科学发觉之首microRNA研究专题知识专家讲座第2页DNARNA蛋白质基因组学RNA组学蛋白质组学microRNA研究专题知识专家讲座第3页蛋白质编码基因数量人：30,000果蝇和线虫：12,000-14,000酿酒酵母：6,200假单孢菌：5,500人和鼠蛋白质编码基因99%是共同。人个体间单倍体基因组碱基差异300万个，其中1万个（0.3%）出现在蛋白质编码基因中。98%转录产物是非编码蛋白RNA。2倍2倍microRNA研究专题知识专家讲座第4页RNA分类细胞核和胞液线粒体功效核蛋白体RNArRNAmtrRNA核蛋白体组成成份信使RNAmRNAmtmRNA蛋白质合成模板转运RNAtRNAmttRNA转运氨基酸不均一核RNAhnRNA成熟mRNA前体小核RNAsnRNA参加hnRNA剪接、转运小胞浆RNAscRNA/7SL-RNA蛋白质内质网定位合成信号识别体组成成份microRNA研究专题知识专家讲座第5页非编码RNA(ncRNA)：不被翻译成蛋白质RNA，这些RNA不被翻译成蛋白质，不过参加蛋白质翻译过程。NoncodingRNAs(ncRNAs)ineukaryotesSmallRNA(sRNA)inbacteriaSmallnuclearRNAs(snRNAs)SmallnucleolarRNAs(snoRNAs)MicroRNA(miRNA)SmalltemporalRNAs(stRNAs)SmallinterferingRNAs(siRNAs)RNAinterference(RNAi)GuideRNAs(gRNAs)tRNA/mRNA:tmRNAmicroRNA研究专题知识专家讲座第6页有些小RNA分子能直接调控一些基因开关从而控制细胞生长发育并决定细胞分化组织类型小RNA分子本身又包含了若干类RNA，依据小RNA生成、结构和功效大约可分为以下三类：miRNA（microRNA)siRNA(smallinterferingRNA)其它小RNAmicroRNA研究专题知识专家讲座第7页micoRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物中一组短小、不编码蛋白质RNA家族，它们是由19-23个核苷酸组成单链RNA（3‘端可有1~2个碱基长度改变）表示含有组织特异性和阶段特异性。即：在不一样组织中表示有不一样类型miRNA；在生物发育不一样阶段里有不一样miRNA表示与靶mRNA3’-UTR结合，序列特异性在转录后水平调控基因翻译表示，在生物发育、脂肪代谢、细胞分化、增殖和凋亡等过程中发挥着主要作用microRNA研究专题知识专家讲座第8页miRNA含有高度保守性，即各种miRNA都能在其它种系中找到同源体；miRNA独有特征：其5’端第一个碱基对U有强烈倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，普通来讲，除第四个碱基外，其它位置碱基通常都缺乏CmiRNA执行一定生物学功效：对与其互补mRNA表示水平含有调整作用；一些偏大miRNA(27nt)可能参加了基因组重组装参加生物发育与各种生理、病理过程microRNA研究专题知识专家讲座第9页为何miRNAs非常主要?microRNAs是一类新基因调控因子一些miRNAs控制了动植物发育了解miRNA功效将有利于现在流行siRNA

microRNAs有可能成为新型疾病标志物microRNAs可能含有主要临床应用价值试验结果：RNA干扰／基因缄默microRNA研究专题知识专家讲座第10页1993microRNA研究历史Dr.VictorAmbrosmicroRNA研究专题知识专家讲座第11页1993microRNA研究专题知识专家讲座第12页1993microRNA研究专题知识专家讲座第13页1993年命名为microRNAmicroRNA研究专题知识专家讲座第14页1993年入选《science》年度十大科学发觉之首microRNA研究专题知识专家讲座第15页1993ThefirstdemonstrationofalinkbetweenmiRNAgenesandcancer.microRNA研究专题知识专家讲座第16页1993miRNAcontrolssomeplantphenotypemicroRNA研究专题知识专家讲座第17页1993Thefirstquantitativereal-timePCRdevelopedformiRNAprofiling,designedfortheamplificationofprecursormolecules.microRNA研究专题知识专家讲座第18页1993ThefirststudytoreportonmiRNAprofilingusinganoligonucleotidemicrochip.Thefirstpapertoexplore,byusinggenome-widemiRNAprofilingbymicroarray,thepotentialimportanceofmiRNAsinthediagnosisandprognosisofahumanmalignancymicroRNA研究专题知识专家讲座第19页1993AnelegantstudythatshowsapathogeneticlinkbetweenmiRNAsandtargetoncogenes.microRNA研究专题知识专家讲座第20页1993ThefirstpapertoshowthatthederegulationofasinglemiRNAgenecanleadtocancer.microRNA研究专题知识专家讲座第21页1993经过生物信息伎俩分析了microRNA在蛋白相互作用网络和转录因子-microRNA相互调控网络中作用microRNA研究专题知识专家讲座第22页199321-ntdsRNAstargetingselectedpromoterregionsofhumangenescausedlong-lasting

andsequence-specificinductionoftargetedgenesmicroRNA研究专题知识专家讲座第23页1993Nature

449,682-688(11October)|microRNA研究专题知识专家讲座第24页1993SangerRelease10.0contains5071

hairpinprecursormiRNAs,expressing

4922maturemiRNAproducts,in

primates,rodents,birds,fish,worms,

flies,plantsandvirusesinAugust

microRNA研究专题知识专家讲座第25页microRNAshadbeenneglectedforsomanyyearsbecauseoftheirsmallsize.Theunderlyingreasonis:peopleneverdreamthatsmallRNAswillhaveimportantbiologicalroles.

microRNA研究专题知识专家讲座第26页What’snewaboutmiRNAresearchinrecentdays?16001200No.ofpublications:

5,209

by10/1/14281307

940 828800 484400 163026361993YearNo.ofpublicationsmicroRNApublicationsincreasedveryrapidly8186papers/.07.19microRNA研究专题知识专家讲座第27页7By:145genes/152maturemiRNAs(SangerRelease3.0)By:192genes/207maturemiRNAs(SangerRelease5.1)By:281genes/319maturemiRNAs(SangerRelease7.1)

By:411genes/455maturemiRNAs(SangerRelease9.0)

By:541genes/733maturemiRNAs(SangerRelease10.1)

By:695genes/866maturemiRNAs(SangerRelease12.0)

TotalnumberofmiRNAgenespredicted:What’snewaboutmiRNAresearchinrecentdays?~1,000(Landgrafetal.,TuschlLab)>25,000(Mirandaetal.,IBMBioinformaticsGroup)MicroRNApublicationsincreasedveryrapidlyHowmanymiRNAsarethereinhuman?microRNA研究专题知识专家讲座第28页8What’snewaboutmiRNAresearchinrecentdays?MicroRNApublicationsincreasedveryrapidlyHowmanymiRNAsarethereinhuman?WhatregulatesmiRNAs

?

(Heetal.;Diederichs&Harber;Rubyetal.;Viswanathanetal.)NewroleofmiRNAsastumorsuppressors

(Heetal.;Mayretal.)

andtumorinvasionandmetastasis

(Maetal.)MicroRNAsregulatestemcellself-renewalanddifferentiation

(Wangetal.;Parketal.;Yuetal.;Yietal.;Tayetal.)MicroRNAsfunctioninimmunesystems

(Lietal.;Rodriguezetal.;Thaietal.)ViralmiRNAsregulate(HIVorHSV-1)replication

(Tribouletetal.;Umbachetal.)MicroRNAscantarget3’-UTR,5’-UTRandcodingregions

(Lytleetal.;Easowetal.;Tayetal.)microRNA研究专题知识专家讲座第29页microRNA加工成熟与分布microRNA研究专题知识专家讲座第30页据体内外试验研究表明miRNA生成需要两个步骤：1)由长内源性转录本（pri-miRNA)经Drosha酶作用生成70nt左右miRNA前体(pre-miRNA)，该过程发生在细胞核2)将pre-miRNA经Dicer酶作用加工为成熟miRNA，该过程发生在细胞质中。microRNA加工成熟microRNA研究专题知识专家讲座第31页microRNA是动、植物本身基因组编码形成一类小分子microRNA研究专题知识专家讲座第32页首先由基因组转录形成长链RNA分子——pri-miRNAmicroRNA研究专题知识专家讲座第33页约60%microRNA为独立转录表示；约15%miRNA为成簇存在而共同转录；其余还有约25%miRNA定位于功效基因内含子，随基因转录表示。microRNA研究专题知识专家讲座第34页Pri-miRNA经双链RNA核酸酶Drosha酶作用，加工形成70-100nt长度pre-miRNAmicroRNA研究专题知识专家讲座第35页Pre-miRNA在Exportin5介导作用下转运出胞核至胞质中进行下一步加工microRNA研究专题知识专家讲座第36页Pre-miRNA在胞质中经双链RNA核酸酶Dicer酶作用加工形成单链成熟miRNA分子microRNA研究专题知识专家讲座第37页Overall,98of186(52.5%)ofmiRgenesareincancer-associatedgenomicregionsorinfragilesitesmicroRNA分布microRNA研究专题知识专家讲座第38页microRNA作用机制microRNA研究专题知识专家讲座第39页miRNA发挥作用过程19-23nt成熟miRNA形成后与其它蛋白共同组成RNA介导缄默复合体（RISC）参加RNA干扰路径microRNA研究专题知识专家讲座第40页miRNA形成RISC复合体后可与特定靶mRNA结合，这种结合不要求严格互补配对。结合后造成靶mRNA翻译抑制翻译抑制microRNA研究专题知识专家讲座第41页5’endofthesmallRNA,2–8,knownasthe“seedregion”donothaveacomplex

secondarystructureandarelocatedinaccessibleregionsofthe

RNAmicroRNA识别靶位点microRNA研究专题知识专家讲座第42页microRNA作用机制microRNA研究专题知识专家讲座第43页microRNA研究专题知识专家讲座第44页miRNA与siRNA联络：均为Dicer产物长度均为22nt左右，5’端是磷酸基，3’端是羟基均需Argonaute家族蛋白存在同为RISC组分二者进化关系上可能两种推论：siRNA是miRNA补充miRNA在进化过程中替换了siRNA缄默机制有重合microRNA研究专题知识专家讲座第45页miRNA加工成熟过程与RNAi技术中惯用siRNA有许多相同之处——均经过Dicer酶对双链RNA识别加工而形成单链RNA分子。microRNA研究专题知识专家讲座第46页miRNAsiRNA产生细胞内RNA固有组分之一（正常）RNAi活性形式，病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生（异常）起源内源转录本转基因或病毒RNA（外源）直接起源发夹状pre-miRNA长dsRNA结构单链双链，3‘端有2个非配对碱基，通常为UU互补性不完全互补，存在错配现象完全互补对靶RNA特异性相对较低，一个突变不影响miRNA效应较高，一个突变即引发RNAi缄默效应改变路径miRNA路径RNAi路径对RNA影响在RNA代谢各个层面进行调控降解靶mRNA功效调整内源基因表示，在蛋白质合成水平发挥作用，与mRNA稳定性无关抑制转座子活性和病毒感染，在转录后水平发挥作用,影响mRNA稳定性miRNA与siRNA区分microRNA研究专题知识专家讲座第47页microRNA与肿瘤microRNA研究专题知识专家讲座第48页•Oncology

–Bladder –Breast –Cervical –Colon –Leukemia –Lung –Pancreas –Prostate –Thyroid•Brain

–Alzheimers –MultipleSclerosis –PrionDisease –Stroke•Miscellaneous –Atherosclerosis –CardiacHypertrophy –Diabetes –HIV/HPVInfection –Lupus•CellularProcess –Angiogenesis –Apoptosis –CellCycle –NeuronalDifferentiation –Proliferation –TelomeraseActivity –T-cellActivation –VariousCellTreatmentmiRNADiseaseAnalysismicroRNA研究专题知识专家讲座第49页microRNA研究专题知识专家讲座第50页microRNA研究专题知识专家讲座第51页microRNA与肿瘤microRNA研究专题知识专家讲座第52页のE2F1E2F1Tsp1CTGFmicroRNA研究专题知识专家讲座第53页miR-17–92簇miR-17–92簇位于13q31，其中包含了7个microRNA:miR-17-5p,miR-17-3p,miR-18,miR-19a,miR-20,miR-19b-1和miR-92-1O'Donnell等发觉MYC能够结合到miR-17-92簇所在基因C13orf25第一个内含子上，并诱导miR-17-92簇表示microRNA研究专题知识专家讲座第54页与p53相关miRNAmicroRNA研究专题知识专家讲座第55页

-06-06microRNA研究专题知识专家讲座第56页microRNA研究专题知识专家讲座第57页肿瘤有着独特miRNA表示谱microRNA研究专题知识专家讲座第58页microRNA研究专题知识专家讲座第59页microRNA相关研究microRNAExpressionAnalysismicroRNAFunctionalAnalysismicroRNA研究专题知识专家讲座第60页miRNAExpressionAnalysis

——StrategyOverviewSamplepreparationRNAisolationcDNAsynthesisReal-timePCRanalysismicroRNA研究专题知识专家讲座第61页microRNAcDNAsynthesisstem-loopRTpoly(A)tailRTmicroRNA研究专题知识专家讲座第62页Real-timePCRworkflowmicroRNA研究专题知识专家讲座第63页microRNAreal-timePCRSYBRGreenTaqmanprobemicroRNA研究专题知识专家讲座第64页microRNA研究专题知识专家讲座第65页microRNA研究专