生物制药工艺技术基础

关于生物制药工艺技术基础生化制药的六个阶段

1.原料的选择和预处理

2.细胞的粉碎

3.提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。

4.纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。

5.浓缩、干燥及保存

6.制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。第2页,共80页，2024年2月25日，星期天第一节

生物材料与生物活性物质一、

生物材料的来源概述：1.

动、植物、微生物的组织、器官、细胞与代谢产物是生产生物药物的生物资源；2.

动植物细胞培养与微生物发酵技术是获得生物制药原料的重要途径；3.基因工程技术、细胞工程技术和酶工程技术是开发生物制药资源的新途径。

第3页,共80页，2024年2月25日，星期天第4页,共80页，2024年2月25日，星期天（一）

动物脏器主要来源是猪、牛、羊和家禽、鱼类等的脏器，包括胰脏、脑、胃粘膜、肝脏、脾脏、小肠、脑垂体和心脏等。1.

胰脏位于胃的后方，横于腹后壁，是动物体内不可替代的实质性腺体之一。分泌胰岛素和胰高血糖素，调节糖的代谢；还分泌各种消化酶，如胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。已用胰脏提取的生物药物有40多种。2.

脑脑组织富含脂质，脑组织中脂类占13.5%，蛋白质占8-10%，脂类物质主要是磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、脑苷脂、神经节苷脂和胆固醇，还有神经递质和多种神经肽。第5页,共80页，2024年2月25日，星期天3.

胃其位置、形态因人而异，一般在左上腹，瘦长型的人常为垂直的长胃。为动物的消化器官，主要分泌消化液，如胃蛋白酶、组织蛋白酶、胶原蛋白酶等。4.

肝脏位于右上腹部，是机体内最大的实质性腺体，是机体的“生化反应器”，含有复杂的酶系。已知的肝脏酶达数百种。用肝脏可制备肝注射液、肝水解物、肝细胞生长因子、造血因子等。5.

脾脏位于胃的左后侧,左侧9-11肋骨内侧的一个长圆形暗红色器官,是体内最大的周围淋巴器官、免疫器官，已用于生产的药物有脾水解物、脾RNA和脾转移因子。第6页,共80页，2024年2月25日，星期天6.

小肠消化和吸收的主要场所，小肠的长度在成人平均是5-7米，含有30多种胃肠道激素。7.

脑垂体悬垂于脑的底部，体积很小，总重量不到1克，但结构复杂，包括腺垂体和神经垂体两部分，分泌的激素种类多，作用广泛，并能调节其他内分泌腺的活动。8.心脏位于胸腔内，膈肌的上方，二肺之间，是一个厚壁的肌性有腔器官，具有节律性的收缩能力。心脏含有丰富的糖元、激素和酶类，用心脏为原料生产的药物主要有细胞色素C、辅酶Q10和心血通注射液。

第7页,共80页，2024年2月25日，星期天（二）

血液、分泌物和其他代谢物以血液为原料可生产多种药物，如凝血酶、血红蛋白、SOD、干扰素等。其他，如尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料。第8页,共80页，2024年2月25日，星期天（三）

海洋生物海洋生物约占全球生物的一半，估计多达5亿种，是开发新药的重要宝库。1.

海藻已从藻类生物中发现、提取了一些抗肿瘤、防治心血管疾病、治疗慢性气管炎、驱虫、抗放射线物质等。2.腔肠动物属于原始多细胞动物，已应用的不多，已提取的有前列腺素类、萜类抗菌物质、抗癌物质。

第9页,共80页，2024年2月25日，星期天3.节肢动物其中的某些甲壳动物（包括虾、蟹）可供药用，从中提取的甲壳素可用于甲亢、肿瘤、肝炎、肾炎和糖尿病等的辅助治疗，另外在食品工业上有重要用途，如用于废水处理、食品添加剂、减肥。4.软体动物包括螺、蚌类和乌贼等，已从其中提取出一些具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、降血脂、止血、平喘作用的多糖、多肽、毒素等。5.棘皮动物包括海星、海胆、海参，关于海胆的研究很多，已提取到不少药物，还发现了在化工方面的应用。第10页,共80页，2024年2月25日，星期天6.鱼类可制造多种药物，最常用的是鱼肝油。7.爬行动物海生爬行动物有海蛇、海龟等，海蛇毒液含有多种酶类。8.海洋哺乳动物从鲸鱼、海豚，可以提取多种药物。第11页,共80页，2024年2月25日，星期天（四）

植物药用植物品种繁多，除含有生物碱、强心苷、黄酮、皂苷、挥发油、树脂、鞣质等有效药理成分外，还含有氨基酸、蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、维生素等生化成分。如天花粉蛋白、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝集素、多糖等。第12页,共80页，2024年2月25日，星期天药用植物中的主要药理成分：1.生物碱，是生物体中一类含氮有机化合物的总称，它们有类似碱的性质，能和酸结合成盐。如麻黄碱、吗啡。2.强心苷，是一类对心肌有兴奋作用，具有强心生理活性的成分，它们的分子中都有一个C17位被不饱和内酯环所取代的甾体母核。如洋地黄毒苷。3.黄酮，系两个芳环通过三碳链相互连结而成的一系列化合物，大多数具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷。银杏中含银杏素、异银杏素、白果素等都是黄酮类，它们具有解痉、降压、扩张冠状血管等药理作用。第13页,共80页，2024年2月25日，星期天4.皂苷，是一类比较复杂的化合物，它们的水溶液振摇时能产生大量持久的蜂窝状泡沫，与肥皂相似，故名皂苷。它们有减低液体表面张力的作用，可以乳化油脂，用做去垢剂。人参中含皂苷总量约4%。5.挥发油，是具香味和挥发性、可随水蒸气蒸馏的易流动的油状液体。它们多数具有多方面的药理作用，如解表、发汗、驱风、镇痛、杀虫、抗菌。薄荷、茴香、樟木、桂皮都含有挥发油。6.树脂，常与挥发油、树胶、有机酸等混合存在，与挥发油共存的称油树脂，与树胶共存的称胶树脂，与芳香族酸共存的称香树脂。药用的如松香、乳香、没药、安息香等.第14页,共80页，2024年2月25日，星期天7.鞣质，又称丹宁，鞣酸，是存在于植物中的一类分子较大的复杂多元酚类化合物，可与蛋白质结合成不溶于水的沉淀，故能与生兽皮结合而形成致密、柔顺、不易腐败又难以透水的皮革，所以称为鞣质。茶叶、柿子中含有丰富的鞣质。鞣质可用于解毒、抗菌、治疗烧伤（使创面收敛、干燥、结痂）。第15页,共80页，2024年2月25日，星期天（五）

微生物微生物资源非常丰富，其代谢产物有1300多种，已大量生产的才近100种，微生物酶有几千种，已被应用的才几十种，可见其应用前景广阔。1.

细菌常用细菌发酵法生产乳酸（消毒防腐药，用于空气消毒）、醋酸、丙酮、丁酸，它们在医药工业应用很广。利用细菌生产氨基酸、有机酸、糖类、核苷酸类、维生素、酶，发展潜力很大。用埃希氏大肠杆菌生产的天冬酰胺酶是治疗肿瘤的第一个酶制剂。第16页,共80页，2024年2月25日，星期天2.

放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有的1000多种抗生素产自放线菌；还利用放线菌生产氨基酸、核苷酸类、维生素、酶。3.

真菌可以利用真菌生产酶、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、促生素、多糖；还可以直接利用真菌本身作为药物，如灵芝、银耳、冬虫夏草。4.

酵母菌可生产维生素、蛋白质、多肽和核酸等。第17页,共80页，2024年2月25日，星期天（六）

开发生物新资源1.

动植物细胞的大规模培养2.应用基因工程技术，生产各种生物活性物质，尤其适合于在自然界中含量低、活性高的一些微量物质的生产。

第18页,共80页，2024年2月25日，星期天二、

生物活性物质的存在方式（一）

生物活性物质的存在方式与其生物功能生物活性物质分为“胞内”与“胞外”两种存在部位。存在于细胞内的生物活性物质有些游离在胞浆中，有些结合于质膜或器膜上，或存在于细胞器内。对于胞内物质的提取要先破碎细胞；对于膜上物质则要选择适当的溶剂使其从膜上溶解下来。第19页,共80页，2024年2月25日，星期天（二）

生物分子间的作用力生物分子间主要是通过一些非共价键，如氢键、盐键、金属键、范德华力、疏水键、碱基堆积力所维系，其键能较弱；生物大分子的空间高级结构也是由非共价键结合的，因此分离时应十分小心，确保立体结构不受破坏。通常在十分温和条件下操作。第20页,共80页，2024年2月25日，星期天三、生物活性物质的存在特点（一）生物材料组成的复杂性不同生物含有不同种类的活性物质。同种生物，由于细胞的类型、年龄、分化程度的不同都会改变活性物质的组成。如：胸腺激素只能从幼龄动物中提取；绒毛膜促性腺激素(HCG)只能从孕妇尿中提取。第21页,共80页，2024年2月25日，星期天（二）

生物活性物质存在的特点1.生物活性物质在生物体材料中含量较低、杂质含量很高。例如：胰岛素在胰脏中的含量约为万分之二，胆汁中的胆红素含量为万分之五至八。2.生物材料中的生化组成数量大，种类多，目的物与杂质的理化性质接近，分离纯化困难。第22页,共80页，2024年2月25日，星期天四、

生物材料的准备

（一)

生物材料的选取

选择原则：有效成分含量高，原料新鲜、无污染；来源丰富、易得；原料产地较近，价格低廉；原料中杂质含量少，便于分离纯化等。

1.

有效成分的含量(1)生物品种：催乳素以哺乳动物为材料(2)合适的组织器官：免疫球蛋白以血液为原料(3)生物的生长期2.

杂质情况3.

来源第23页,共80页，2024年2月25日，星期天

（二）

生物材料的采集、预处理与保存采集：必须快速、及时速冻、低温保存。预处理：1、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。2、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，以便抑制微生物和酶的作用。3、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，有利于贮存。保存方法：有速冻、冻干、或浸存于丙酮与甘油中。第24页,共80页，2024年2月25日，星期天第二节细胞破碎

在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适度的粒度，或将细胞破碎，使胞内活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。

动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎；

植物肉质组织：常用磨碎法；

微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等处理方法。

第25页,共80页，2024年2月25日，星期天1.机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。2.物理法

A、反复冻融法：把待破碎的样品冷至-20℃-15℃

，使之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物细胞及细胞内的颗粒可以破碎。

B、冷热交替法：将材料投入沸水中，在90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。

第26页,共80页，2024年2月25日，星期天

C、超声波处理法：多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用50~100mg/L菌体浓度，在1~10KC频率下处理10~15min。操作时注意避免溶液中气泡的存在。

D、加压破碎法：加气压或水压，达0.59~34.32MPa(210~350kgf/cm2)的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。第27页,共80页，2024年2月25日，星期天3.化学法：

用稀酸、稀碱、浓盐、有机溶剂、表面活性剂处理细胞。4.生化法：

A.自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4℃，微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。第28页,共80页，2024年2月25日，星期天4.生化法：

A.自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4℃，微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。*由于自溶时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸和蛋白质时比较少用。第29页,共80页，2024年2月25日，星期天

B.溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。多用于微生物。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8.0的0.1mol/LTris-0.01mol/LEDTA制成2亿个/mL的细胞悬液，然后加入100μg~1mg的溶菌酶，在37oC保温10min，细菌胞壁即被破坏。第30页,共80页，2024年2月25日，星期天一、提取方法1.

用酸、碱、盐水溶液提取用于提取各种水溶性、盐溶性的生化物质，这类溶剂提供了一定的离子强度、pH值及相当的缓冲能力。某些与细胞结构结合牢固的生物大分子，在提取时采用高浓度盐溶液（如4mol/L盐酸胍，8mol/L脲或其他变性剂，这种方法称“盐解”）。

第三节生物活性物质的提取第31页,共80页，2024年2月25日，星期天2.

用表面活性剂提取表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，在分布于水-油界面时有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂可分为阴离子型、阳离子型、中性与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但易引起蛋白质等生物大分子的变性；非离子型表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的蛋白质或酶的提取。阴离子表面活性剂SDS可以破坏核酸与蛋白质的离子键合，对核酸酶又有一定抑制作用，因此常用于核酸的提取。第32页,共80页，2024年2月25日，星期天表面活性剂的亲油、亲水性能的强弱，通常以亲水亲油平衡值（H.L.B）表示：

H.L.B=亲水基的亲水性/亲油基的亲油性生物提取常用的表面活性剂，其H.L.B多在10-20之间。经表面活性剂处理后，它的存在对酶蛋白等的进一步纯化带来一定困难，如盐析时很难使蛋白质沉淀，因此需先除去。离子型表面活性剂可用离子交换层析法除去；非离子型表面活性剂可用亲脂性葡聚糖凝胶层析法除去；其他表面活性剂可用分子筛层析法除去。第33页,共80页，2024年2月25日，星期天3.

有机溶剂提取（1）固-液提取，常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶等的提取。包括单一溶剂分离法、多种溶剂组合分离法。常用的有机溶剂：极性溶剂，甲醇、乙醇、丙酮、丁醇。非极性溶剂，乙醚、氯仿、苯。选用有机溶剂，一般采用“相似相溶”原则。

采用有机溶剂，既能抑制微生物的生长和某些酶的作用，防止目的物降解失活，也能阻止大量无关蛋白质的溶出，有利于进一步纯化。第34页,共80页，2024年2月25日，星期天（2）液-液萃取概念：利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响因素：

目的物在两相的分配比（分配系数K）；

有机溶剂的用量。

K增大，提取效率增大。

K值较小时，可以适当增加有机溶剂的用量，采用多次提取。第35页,共80页，2024年2月25日，星期天溶剂萃取的注意事项：

1.pH值，酸性物质在酸性条件下萃取；碱性物质在碱性条件下萃取；氨基酸等两性电解质，则采用在等电点进行提取。2.盐析，在提取液中加入适量中性盐，促使生化物质转入有机相，从而提高萃取率。并且，盐析作用能减少有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。3.温度，室温或低温下操作。因为温度升高，既使生物材料不稳定，又易使有机溶剂挥发。

4.乳化，乳化层出现使有机相与水相分层困难。消除乳化的方法包括过滤、离心、轻轻搅动、改变两相的比例、加热、加电解质（NaCl,NaOH,HCl）、加吸附剂（CaCO3）。第36页,共80页，2024年2月25日，星期天

液-液萃取时，溶剂的选择：l

具有较高选择性，即K值较大。l

在萃取后，溶质与溶剂容易分离与回收。l

两种溶剂的密度相差较大，以减少乳化作用。l

无毒，不易燃烧，价廉。

第37页,共80页，2024年2月25日，星期天超临界萃取优点：节能，可使用生理惰性溶剂在低温下分离组分，有利于生物材料活性的保持，原理：在某一温度和压力时，气体和液体的物理特性趋于相同，两相变为一相，此时就称为临界点。物质的临界点常数包括：临界温度、临界压力和临界密度。对于CO2而言，分别为31.1℃、7.3Mpa和0.47g/mL。当温度和压力高于上述值时，物质处于液体和气体的中间状态，在这种状态下的流体称为超临界流体。超临界流体最常用的萃取剂是CO2。第38页,共80页，2024年2月25日，星期天超临界流体的特性：它们的物理特性和传质特性介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。超临界流体具有与液体同样的凝集力，溶解力。超临界流体的密度比气体大得多，与液体较为接近，因此超临界流体萃取具有很高的萃取速度。随着温度和压力的连续变化，超临界流体对物质的萃取具有选择性。萃取后易分离，其扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍。超临界流体的粘度大大低于液体的粘度，有利于物质的扩散，节能效果明显。超临界流体的萃取过程：分为萃取阶段和分离阶段。第39页,共80页，2024年2月25日，星期天二、提取效率

任何提取的提取效率都不可能达到100%，无论采用什么提取方法，在生物材料中总要残留部分目的物，残留量的多少取决于所选择的溶剂系统的种类、用量、提取次数及操作条件，它们的数量关系可以“残留量公式”表示如下：

式中，X0为目的物总量,g；

K为目的物在固相/液相的分配系数；

L为溶剂体积,ml；

W为生物材料重量,g；

n为提取次数。第40页,共80页，2024年2月25日，星期天由上式可见：1.

对于所选的溶剂系统而言，目的物在材料中的分配系数愈大，提取后的残留物质就愈多。2.

所用的溶剂愈多，残留量愈少。3.

提取次数愈多，残留量愈少。实际工作中，溶剂的用量与提取次数有一定的限制，一般生产上多用2-3次提取，溶剂用量为生物材料的2-5倍。第41页,共80页，2024年2月25日，星期天三、影响提取效率的因素1.

温度大多数不耐热的生物活性物质一般在0-10℃进行提取。某些较耐热的生化成分，如多糖类，可于50～90℃加热提取。2.

酸碱度多数生化物质在中性条件下较稳定，所以提取用的溶剂系统一般pH值控制在4-9范围内，并且注意避免在目的物的等电点附近进行提取。第42页,共80页，2024年2月25日，星期天3.

盐浓度盐离子的存在能减弱生物分子间离子键及氢键的作用力，稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。盐溶：一些不溶于纯水的球蛋白在稀盐中能增加溶解度，这是由于盐离子作用于生物大分子表面，增加了表面电荷，使之极性增加，水合作用增强，促使形成稳定的双电层，此现象称为“盐溶”作用。常用的稀盐提取液：

NaCl溶液(0.1-0.15mol/L)；

磷酸盐缓冲液（0.02-0.05mol/L)；

焦磷酸钠缓冲液（0.02-0.05mol/L)；

醋酸盐缓冲液（0.10-0.15mol/L)；

柠檬酸缓冲液（0.02-0.05mol/L)。第43页,共80页，2024年2月25日，星期天

四、提取方法的选择关键：针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。重点了解目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。在提取过程中，尽量增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度，同时重视生物材料及目的物在提取过程中的活性变化。第44页,共80页，2024年2月25日，星期天

活性物质的保护措施1.

采用缓冲系统2.

添加保护剂——防止活性基团受破坏3.

抑制水解酶的作用4.

其他保护措施避免紫外光、强烈搅拌、过酸、过碱或高温第45页,共80页，2024年2月25日，星期天第四节

生化物质的分离纯化方法一、

生物制药中分离、制备方法的特点1.

生物材料组成复杂——无固定操作方法可循；2.

含量极微——分离操作步骤多，不易获得高收率；3.

活性成分离开生物体后，易变性，破坏——分离进程必须十分小心；4.

分离几乎都在溶液中进行——按经验进行，严格控制；5.

分离多采用温和的“多阶式”方式进行，即“逐级分离”。操作时间长，手续繁琐。6.生物产品最后均一性的评估，要采用多种方法。

第46页,共80页，2024年2月25日，星期天二、

生物制药中分离制备方法的基本原理1.

根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心、超离心、膜分离、超滤、凝胶过滤；2.

根据分子电离性质（带电性）的差异，如离子交换、电泳、等电聚焦；3.

根据分子极性大小及溶解度不同，如溶剂提取法、逆流分配、分配层析、盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级沉淀；4.

根据物质吸附性质的不同，如选择性吸附与吸附层析；5.

根据配体特异性，如亲和层析。第47页,共80页，2024年2月25日，星期天三、

生物制药中常用的分离纯化方法1.

盐析法；2.

有机溶剂沉淀法；3.

等电点沉淀法；4.

膜分离法；5.

离子交换层析；6.凝胶层析；7.亲和层析。第48页,共80页，2024年2月25日，星期天1、盐析法利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度随着盐浓度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐析作用。

优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。

缺点：分级分离能力不高。

常用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠。

第49页,共80页，2024年2月25日，星期天盐析时应注意的几个问题：（1）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。（2）pH值的选择：蛋白质在pI时的溶解度最小。因此，进行盐析时的pH，要选择在被分离蛋白质的pI附近。（3）蛋白质浓度：在相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其他蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选择适当的蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。第50页,共80页，2024年2月25日，星期天

（4）温度：一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。

常在0-4℃范围内迅速操作。如尿激酶。（5）盐析沉淀物的脱盐：盐析的沉淀分离后，经脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析，时间一般较长，应常换透析液，注意防止污染。第51页,共80页，2024年2月25日，星期天

2、有机溶剂沉淀法利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离目的蛋白质的方法。蛋白质的沉淀与溶解，与溶剂的介电常数有关。降低溶液的介电常数，使其溶解度变小，同时，还破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀析出。

第52页,共80页，2024年2月25日，星期天几种溶剂的介电常数溶剂名称20℃时的介电常数溶剂名称20℃时的介电常数乙醚4.33甲醇33

丙酮21.4水80

乙醇242.5mol/L甘氨酸水溶液137介电常数与静电力的关系：F=Q1Q2/Kr2

式中：K—介电常数。指带相反电荷的微粒之间的静电引力。

F—相距为r的2个带电量分别为Q1、Q2点电荷相互作用的静电引力。经验：如30-40%乙醇沉淀的物质，改用丙酮时，其体积分数可减少10%左右。即可用20—30%的丙酮；而70-80%乙醇沉淀的物质，可用50—60%的丙酮即可。注：水有较高的介电常数，具有很好的溶剂性能，是一种广谱溶剂。有机溶剂法比盐析法分辨力强，沉淀也好过滤，易干燥，但对有些生物活性物质能引起失活和变性。应用时还要注意挥发和火灾等。第53页,共80页，2024年2月25日，星期天有机沉淀法应注意的问题：

（1）控制工艺过程的温度：整个操作过程应在低温下进行，而且最好是同一温度。（2）防止溶剂局部浓度过高：加入有机溶剂时搅拌要均匀，速度要适当，避免局部浓度过高，引起沉淀物的破坏、变性或失活。（3）及时处理沉淀物：沉淀物经过滤或离心后，要立即用水或缓冲液溶解，降低有机溶剂的浓度。（4）pH的选择：在待沉淀蛋白质的pI附近。（5）有机溶剂是酶和蛋白质的变性因素，尤其是对敏感酶类。第54页,共80页，2024年2月25日，星期天3、等电点沉淀法利用蛋白质在等电点时的溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同的等电点的特性进行分离的工艺过程。由于各种蛋白质在等电点时，仍有一定的溶解度而沉淀不完全，多数蛋白质的等电点又都十分接近，所以单独使用效果不理想，分辨力差，多用于提取后除杂蛋白。实际生产中常与有机溶剂沉淀法、盐析法联合使用。第55页,共80页，2024年2月25日，星期天4、膜分离法膜分离技术包括超滤、反渗透析、电渗析、微孔过滤、气体渗析和超精密过滤。

（1）超滤：根据溶质分子和悬浮粒子是否通过多孔膜来进行筛分。在液压的驱动下，能通过超滤膜的分离粒子的范围，一般在0.001—0.01μm。即利用一种特制的膜对溶液中的各种溶质分子进行选择性过滤。优点：成本低、操作方便、条件温和、能较好地保持药物活性、回收率高。适用于酶和蛋白质药物的分离、浓缩、脱盐、提纯、除菌、除病毒和热原。

第56页,共80页，2024年2月25日，星期天（2）反渗透：以高分子透过性薄膜为分离介质，在超过溶液渗透压力的情况下，使溶液中的溶剂透过薄膜，同时使溶质和不溶物阻截在膜前。这一过程类似于渗透,但方向相反，即溶剂从高浓度一侧传递到浓度低的一侧，故称反渗透。特点：能耗少，体积小，适应大规模生产。（3）微孔滤膜：由高分子材料制成的薄膜过滤介质，可以过滤一般介质不能截留的细菌和微粒。膜的孔径在0.2-10μm。（4）超精密过滤：以聚乙烯醇为主体的中空多孔滤膜，分级性能在超滤膜与微孔滤膜之间。为0.01－0.2μm。用于水的精制、循环水的净化、除悬浮固体粒子以及糖液、酶液的精制。第57页,共80页，2024年2月25日，星期天5、离子交换层析采用不溶性高分子化合物作为离子交换剂，分离纯化各种生化物质。基本原理：离子交换树脂在水中能溶胀，溶胀后，其分子中的极性基团（活性基团），具有可扩散的离子，能与溶液中的离子起交换作用；非极性基团作为树脂的骨架，使树脂不溶于水并具有网状结构，为离子交换的进行及溶液和树脂的分离创造了条件。离子交换层析包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和力等物理化学过程。

第58页,共80页，2024年2月25日，星期天树脂种类和理化性能：

（1）强酸性阳离子交换树脂：功能团为磺酸基，pH一般没有限制。（2）弱酸性阳离子交换树脂：功能团为羧基、酚基。在酸性溶液中不发生交换，pH愈大交换能力愈强。（3）强碱性阴离子交换树脂：功能团为三甲基季胺基团。pH没有限制。（4）弱碱性阴离子交换树脂：功能团为伯胺基、仲胺基、叔胺基。pH愈低交换能力愈大。第59页,共80页，2024年2月25日，星期天

影响交换速度的因素：（1）树脂颗粒的大小：颗粒小，表面积大，能促进内部和外部扩散。（2）搅拌和流速：加快搅拌速度或加大液体流速，都能减少树脂外液膜的厚度，从而使液相扩散速度增加。（3）离子浓度：交换速度随离子浓度的上升而增加，达到一定浓度后交换速度不再升高。（4）离子的水化半径：水化半径小的易被吸附。（5）树脂酸碱性的强弱和溶液的pH：（6）交联度大小：交联度愈小，树脂愈易膨胀，交换速度愈快。但交联度小的树脂选择性较差。（7）有机溶剂的影响：当有有机溶剂存在时，会降低树脂对有机离子的选择性，而容易吸附无机离子。

第60页,共80页，2024年2月25日，星期天6、凝胶层析指化合物随流动相流经装有凝胶的固定相的层析柱时，因其各种物质分子大小不同而被分离的技术。又称凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤、阻滞扩散层析、排阻层析。

优点：设备简单，操作方便，分离效果好，回收率高，分离条件缓和，不使活性物质失活变性，凝胶可重复使用，无需再生处理。

缺点：分离速度慢。广泛用于分离氨基酸、多肽、蛋白质、酶及多糖等药物。第61页,共80页，2024年2月25日，星期天几种常用的凝胶：

（1）葡聚糖凝胶：基本骨架是1-6糖苷键。由葡聚糖和甘油以醚桥形式交联而成的网状结构。最著名的商品为Sephadex葡聚糖凝胶，珠状颗粒物，化学性质稳定，不溶于水、弱酸、碱和盐溶液。低温时，在0.1mol/L盐酸中保持1-2h不改变性质；室温时，在0.01mol/L盐酸中放置半年也不改变；在0.25mol/L的氢氧化钠中，60℃

两个月没有发改变。可在120℃

加热30min灭菌而不破坏，但高于120℃

即变黄。湿状贮存易发霉，若长期不用，需加防腐剂。

第62页,共80页，2024年2月25日，星期天（2）聚丙烯酰胺凝胶：由碳-碳骨架构成。完全为惰性。稳定性比葡聚糖凝胶好，洗脱时不会有凝胶物质下来。缺点：不耐酸。遇酸时酰胺键会水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。（3）琼脂糖凝胶：天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联。空隙度以契纸糖的浓度来改变，化学稳定性不如葡聚糖凝胶。没有干凝胶，必须在溶胀状态保存，遇脱水剂、冷冻和一些有机溶剂即破坏，丙酮和乙醇对它无影响。在pH4.5-9,温度0-40℃稳定。对硼酸有吸附，不能用硼酸缓冲液。能分离几万到几千万相对分子质量的物质，弥补了葡聚糖和聚丙烯酰胺凝胶的不足。瑞典商品名Sepharose，美国称Bio-GelA,英国称Sagavac.

(4)疏水性凝胶：常用的为聚甲基丙烯酸酯（Polymethacrylate）凝胶、聚苯乙烯凝胶（如Styrogel,Bio-Beads-S）第63页,共80页，2024年2月25日，星期天7、亲和层析生物活性物质都有亲和作用，如酶与底物、激素与受体、核酸的互补链间，多糖与蛋白质复合体。亲和层析是利用生物大分子的特异亲和力而设计的层析技术。可逆结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层析介质称为载体。亲和层析能从粗提液中，通过一次简便处理，便可得到高纯度的活性物质，既可分离一些生物材料中含量极微的物质，又能分离一些性质十分相似的物质。优点：设备要求不高，操作简便，适用范围广，特异性强，分离速度快，效果好，条件温和。缺点：通用性较差，洗脱条件要求苛刻。

第64页,共80页，2024年2月25日，星期天几种常用的载体：

（1）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有关的物质。如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液中的mRNA.市售商品有：无定型微纤维、微晶纤维素、珠状纤维素。第65页,共80页，2024年2月25日，星期天（2）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。其琼脂糖的质量浓度为20g/L(2%)、40g/L(4%)、60g/L(6%)几种，相应的商品称为Sepharose2B、4B、6B(Pharmacia)和UltrogelsA-2,A-4,A-6)。这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。（3）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，特别是经配基偶联后，凝胶膨胀度会进一步变小，所以应用受到限制。（4）聚丙烯酰胺凝胶：碳-碳骨架，有丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，具有网状三维空间结构。商品名为BiogelP。注意避免接触强氧化剂，配基偶联后会使它的网格缩小，在一定程度上限制了它的应用。

第66页,共80页，2024年2月25日，星期天（5）多孔玻璃珠：化学和物理稳定性好，机械强度高，不但能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少。改良方法：为了克服其缺点，市售Bio-Glass的商品都已事先连接了氨烷基（烷基胺）。用葡聚糖包被玻璃珠，则可改善其亲水性，并增加化学活性基团。用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在DNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNA和RNA聚合酶。

第67页,共80页，2024年2月25日，星期天（6）其他载体：由聚丙烯酰胺和琼脂糖混合组成的载体，商品名为UltrogelsACA。它的特点是载体上既有羟基又有酰胺基，并且都能与配基单独作用。但不能接触强碱，以免酰胺水解，使用温度不超过40oC。在丙烯酰胺和琼脂糖的混合胶中加入7%的四氧化三铁，则可制得一种称为磁性胶（MagnogelsACA44）的载体。当悬浮液中含有不均匀粒子时，依靠磁性能将载体与其他粒子分离。磁性胶载体常用于酶的免疫测定、荧光免疫测定、放射免疫测定、免疫吸收剂和细胞分离等的微量测定和制备。

第68页,共80页，2024年2月25日，星期天影响吸附亲和力的几个因素（吴梧桐P284）：

（1）配基浓度；（2）空间障碍；（3）配基与载体的结合位点；（4）载体的孔径；（5）微环境（化学因素），包括载体及“手臂”的电性、极性、次级键对配基亲和力的影响。第69页,共80页，2024年2