一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用的制作方法

一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用的制作方法专利名称：：一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用的制作方法技术领域：：本发明涉及一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用，属于基因工程技术领域：。背景技术：：基因工程(geneengineering)，又称为重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质(DNA片段)，在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。按目的基因的克隆和表达系统，分为原核生物基因工程，酵母基因工程，植物基因工程和动物基因工程。基因工程具有广泛的应用价值，为工农业生产和医药卫生事业开辟了新的应用途径，也为遗传病的诊断和治疗提供了有效方法。基因工程还可应用于基因的结构，功能与作用机制的研究，有助于生命起源和生物进化等重大问题的探讨。转基因的高效表达问题是基因工程及基因治疗领域人们最关心的问题之一，但由于位置效应等导致转基因沉默、表达水平较低却是转基因动植物中普遍存在的一种现象。研究发现，有时通过Southernblot、RT_PCR等证实转基因已整合到宿主的基因组中，且保留完整的拷贝，但是却不能稳定表达或表达水平低下，有时甚至完全被抑制。这种外源基因在宿主细胞中表达受到抑制的现象称之为转基因沉默(transgenesilencing)，其主要原因是转基因之间或转基因与内源的同源基因之间存在着序列同源性的缘故。利用核基质结合区(matrixattachmentregion，MAR)是近年来发展起来的克服外源基因失活的一种有效方法。MAR序列，即核基质结合区(matrixattachmentregion,MAR)序列，亦称核骨架结合区(scaffoldattachmentregion,SAR)序列，是真核生物染色质上可与细胞核基质结合的一段特殊DNA序列。目前已有不少利用核基质结合区提高外源基因表达的相关报道。很多实验均已证实，MAR序列能克服外源基因沉默，提高报告基因的转基因表达水平(见王健美，张可伟，叶文静，等.MAR序列研究进展[J].山东农业大学学报(自然科学版)，2002，33(2)244-247.)。不同插入位点的MAR对转基因表达的影口向不同(见ZhangJH,JingCQ,YangXJ,etal.PositionaleffectsofthematrixattachmentregionontransgeneexpressioninstablytransfectedCHOcells[J].CellBiolInt·2010,34(2):141-145.)。即使是同一MAR在不同的表达宿主中对转基因表达的影响亦存在差异(见余惠明，王天云.β-珠蛋白MAR对转基因在不同细胞中表达的影响[J]·第四军医大学学报，2005，26(14):1261-口63.)，另外研究还发现不同来源的MAR对外源基因表达的影响不一(见AllenGC，SpikerS，ThompsonWF.Useofmatrixattachmentregions(MARs)tominimizetransgenesilencing[J].PlantMolBiol,2000,43(2-3):361-376.KimJM,KimJS,ParkDH,etal.ImprovedrecombinantgeneexpressioninCHOcellsusingmatrixattachmentregions[J].JBiotechnol，2004，3107(2):95-105.BrouwerC，BruceW,MaddockS，etal.Developmentofstablecelllinesforproductionorregulatedexpressionusingmatrixattachmentregionsinmaize:adualforthemaize5'ADHlmatrixattachmentregion[J].PlantCell，2002,14(9)2251-2264.)0尽管前期有一些关于利用MAR构建的人类及哺乳动物细胞表达载体的报道，但都存在转基因表达水平不高，载体所介导的为报告基因，载体不含多克隆位点等缺点。发明内容本发明的目的在于提供一种可高效表达目的基因的人类及哺乳动物细胞表达载体。本发明所提供的表达载体，是在pCAT3-C0ntr0l载体骨架上含有β-珠蛋白MAR序列及β-干扰素MAR序列；所述的pCAT3-Control载体骨架上，在SV40启动子上游插入β-干扰素MAR序列，在SV40latepoly(A)region下游插入β-珠蛋白MAR序列；pCAT3-contro1上的CAT基因替换为多克隆位点，该多克隆位点是由限制性内切酶NcoI、SacI、MluI、NheI、XmaIJhoI.XbaI酶切位点所组成，所述的多克隆位点的5'、3'端分别为NcoI.XbaI酶切位点，中间为&icI、MluI、NheI、XmaI.XhoI五个酶切位点的任意排列。所述β-珠蛋白MAR序列的GenBank编号为L22754.1，β-干扰素MAR的GenBank编号为M83137.1。为方便进行真核抗性筛选，在pCAT3-C0ntr0l载体骨架上SV40Enhancer下游插入真核抗性基因选择复合体，该复合体自上游至下游依次包括SV40早期启动子、抗性基因以及HSV-TKpolyA；所述的SV40早期启动子是GenBank中编号为X99274的核苷酸序列的第6850-7187位核苷酸，HV-TKpolyA是GenBank中编号为ABMM35的核苷酸序列的第3867-3885位核苷酸。所述的抗性基因的选择是广泛的，如Neomycin(Neo,Kan/G418耐受)、Zeomycin,Hygromycin或GFP/Neo抗性基因等，优选Neomycin抗性基因，GenBank中编号为AFl13968的核苷酸序列的第2277-3080位核苷酸。所述表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建。本发明的另一个目的是提供一种人类及哺乳动物细胞表达载体的用途。本发明人类及哺乳动物细胞表达载体能够显著提高外源基因的表达，可用于制备基因治疗制剂。本发明提供一种人类及哺乳动物细胞表达载体，该载体是利用pCAT3-C0ntr0l作为出发载体构建的一种表达载体。在本发明的表达载体中的多克隆位点插入目的基因，构建表达载体。本发明的表达载体能够显著提高所携带的目的基因的表达水平，比目前不含MAR及以其他方式插入MAR的表达载体可提高25倍以上。因此，针对目前基因工程领域的基因沉默现象，本发明的表达载体具有显著提高外源基因表达的效果。图1是pCAT3_control载体的物理图谱；4图2是表达载体pMAR的物理图谱；图3是表达载体pMAR-VEGF的物理图谱；图4是实施例2中各实验组及空白对照组的VEGF蛋白表达水平的灰度比值柱形图；1未转化质粒的骨髓干细胞VEGF表达量；2转化不含MAR序列表达载体VEGF表达量；3转化表达盒两侧含有β-珠蛋白MAR表达载体VEGF表达量；4转化本发明所述表达载体VEGF表达量。具体实施例方式下面实施例具体说明本发明所述载体的应用。特别需要指出的是，本发明说明书所举实施例只是为了帮助理解本发明，他们不具任何限制作用，即本发明除说明书所举实例外，还可以有其他实施方式。因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案，均落在本发明要求的保护范围中。本发明实施例中所使用的大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109、pCAT-3-control质粒载体，所使用的细胞系、质粒载体和试剂、工具酶均为市售商品。pCAT-3-control质粒载体购自于Promega生物公司。实施例1表达载体pMAR载体的构建(1)含β-珠蛋白MAR序列的表达载体的PCAMl构建①PCR扩增目的片段根据β-珠蛋白MAR序列(GenBank登录号为L227M.1)，设计引物Pl和Ρ2，引物的5‘端分别引入MlI/BamHI酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)Pl5'-GTCGTCGACAAGCTTCTGACAAATTATTCTTCC-3'；Ρ25'-AGCGGATCCGGATCCTCCCATTTCGGCCTCCTG-3'；提取人外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板，使用引物Pl和Ρ2扩增β-珠蛋白MAR序列，PCR反应体系如下(反应总体系为25μL):PCR艮应体系试剂浓度ftfUpl)终浓度IOxPCRbuffer231X模板DKtAIOOiigZpL1.04血PCR条件如下95°C3min，94°C40s，6056°C30s,72°C40s，每个退火温度4个循环，最后55°C，30个循环，72°C3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证，结果表明，扩增出的DNA片段与Genbank登录的β-珠蛋白MAR序列完全一致。②构建含β-珠蛋白MAR序列的pCAMl载体用MlI/BamHI双酶切β-珠蛋白MAR序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用SalI/BamHI双酶切pCAT3_control质粒DNA，酶切体系为质粒5μL，IOXMbuffer2μL,SalI/BamHI酶各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为37°C，3min。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收β-珠蛋白MAR序列片段和pCAT3-C0ntr0l线形质粒；酶切回收后的β-珠蛋白MAR片段及pCAT3-Control线性质粒DNA，按1:5(摩尔比)进行连接，16°C连接过夜；然后将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将100200μL转化后的Ε.coliJM109菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37°C培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(SalI/BamHI)验证，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为PCAM1。(2)含β-干扰素MAR序列的表达载体的PCAM2构建。①PCR扩增目的片段根据β-干扰素MAR序列(GenBank登录号为Μ83137.1)，设计引物Ρ3和Ρ4，为实现定向克隆，引物的5'端分别引入Bgl11/KpnI酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位占)·P35'-GTCAGACTCGAATTCAGCAAGGTCGCCACGCACA-3'；P45'-GTCGGTACCCTATCAAGATATTTAAAGAAAAAAAAAT-3'；提取人外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板，使用引物P3和P4扩增β-干扰素MAR序列，PCR反应体系如下PCR反应体系试剂浓度体积(μ)终浓度Taq醜5U,'pL0.5OJU/pLPCR条件如下95°C3min，94°C40s，6056°C30s,72°C40s，每个退火温度4个循环，最后55°C，30个循环，72°C3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证，结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank登录的β-干扰素MAR序列完全一致。②构建含β-珠蛋白MAR序列的pCAMl载体用BglII/KpnI双酶切β-干扰素MAR序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用BglII/KpnI双酶切pCAMl质粒DNA，酶切体系为质粒5μL，IOXMbuffer2yL,BglII/KpnI酶各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为37°C，3min。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收β-干扰素MAR序列片段和pCAMl线形质粒；酶切回收后的β-干扰素MAR片段及PCAMl线形质粒DNA，按1:5(摩尔比)进行连接，16°C连接过夜；然后将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将100200μL转化后的Ε.coliJM109菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37°C培养过夜，挑取单菌落继代培养，BglII/KpnI双酶切重组质粒载体，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为PCAM2。(3)含neomycin真核抗性基因选择复合体的表达载体的pCAMN构建。①PCR扩增neomycin真核抗性基因选择复合体根据neomycin真核抗性基因选择复合体序列(GenBank登录号为EF437957.1)。设计引物P5和P6，引物的5'端分别引入MlI酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)P55'-GTCGTCGACCTGTGGAATGTGTGCAGTTAGGGTGTGGA-3'；P65'-AGCGTCGACCAGACATGATAAGATACATTGATGAGA-3'；提取质粒ρ⑶NA3.1，作为PCR扩增的模板，使用引物P5和P6扩增neomycin真核抗性基因选择复合体序列，PCR反应体系同表2，PCR条件如下95°C3min,94°C40s,6030s,72°C408，30个循环，7213min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证，结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank登录的neomycin真核抗性基因选择复合体序列完全一致。②构建含neomycin真核抗性基因选择复合体的表达载体pCAMN用MlI单酶切PCR产物，酶切体系为质粒5yL，10Xbuffer2μL,SalI酶0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为37°C，3min。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收neomycin抗性基因片段(G418筛选)；同时用MlI单酶切载体pCAM2，用碱性磷酸酶处理PCAM2线性质粒；酶切回收后的neomycin抗性基因片段及经碱性磷酸酶处理过的pCAM2按15(摩尔比)用T4连接酶进行连接，16°C连接过夜；然后将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将100200μL转化后的Ε.coliJM109菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37°C培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(SalI/BamHI)验证，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pCAMN。(4)含多克隆位点的表达载体pMAR构建①人工合成多克隆位点根据NcoI、SacI,MluI,NheI,XmaI,XhoI,XbaI的酶切位点序列，设计下列一段序列5‘-GCCAGCCCATGGGAGATCACGGCTGCTAGCCCCGGGCTCGAGTCTAGATAG-3‘，由生物公司合成。②构建含多克隆位点的表达载体pMAR用NcoIAbaI酶切人工合成的多克隆位点DNA片段，酶切pCAMN，酶切体系为质粒5μL，IOXbuffer2μL,Ncol/XbaI酶各0.5μL，补足水至20μL，酶切条件为37°C，:3min。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收；将回收的多克隆位点DNA片段和pCAMN线性质粒按1:5(摩尔比)用T4连接酶进行连接，16°C连接过夜；然后将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将100200μL转化后的Ε.coliJM109菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37°C培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切(NcoIAbaI)验证，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将序列完全正确的载体命名为pMAR(质粒图谱如图2所示)。实施例2利用本发明的表达载体在人骨髓间充质干细胞中表达VEGF基因。(1)含有血管内皮生长因子(VEGF基因)载体pMAR-VEGF的构建根据人的VEGF基因cDNA序列(GenBank登录号为AF022375.1)设计PCR引物P7和P8，为实现定向克隆，引物的5'端分别引入NcoIAbaI酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)P75'-GGCCCATGGATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3'；P85'-GCGAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTG-3'。取胎儿心肌组织，Trizol法提取总RNA，用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。在25μL的反应体系中，分别加入dNTPlμL(10mmol/L),RNA1μg，浓度为20ymol/L的P7和P8引物各1μL，AMV-TaqDNA聚合酶1μL(5U/μL)以及AMV反转录酶1μL(5U/μL)，按照OneStepPCRKit(AMV)操作说明进行RT-PCR反应50°C30min，将mRNA反转录为cDNA；然后按如下参数94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共计30个循环。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证，结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank登录的VEGF基因cDNA序列完全一致；用Ncol/XbaI双酶切VEGF基因的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用NcoIAbaI双酶切pAMR质粒DNA，酶切方法参考实施例1中酶切体系及条件，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收VEGF基因序列片段和pAMR线形质粒；酶切回收后的VEGF基因cDNA序列片段及pAMR线性质粒DNA按1:5(摩尔比)进行连接，16°C连接过夜；然后将连接产物加入到E.coliJM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将100200μL转化后的Ε.coliJM109菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37°C培养过夜，挑取单菌落继代培养，Ncol/XbaI双酶切重组质粒载体，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pMAR-VEGF(质粒图谱如图3所示)。(2)pMAR-VEGF转骨髓间充质干细胞细胞