第十章-基因工程菌发酵

第十章基因工程菌的发酵

基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。基因工程基因工程的核心技术是DNA的重组技术。除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。基因工程一般分为4个步骤：取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；把重组DNA引人某种细胞；把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。工程菌的获得确定目的产物，找出产该产物的细胞。将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。工程菌具备的条件发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。菌株不是致病株，也不产内毒素。代谢控制容易进行。能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。基因工程菌发酵动力学基因工程菌发酵设备基因工程菌的高密度发酵和控制基因工程菌发酵的后处理技术基因工程菌的不稳定性及对策应用案例与分析基因工程菌发酵动力学

基因工程菌发酵动力学模型分类基因工程菌培养过程的动力学模型理想情况：把细胞群体处理为一种溶质不考虑细胞结构，但各种细胞均一细胞之间不均一细胞内部多组分细胞之间无差异细胞内部多组分均衡生长均衡生长非结构模型结构模型平均细胞近似平均细胞近似非离散模型离散模型

非离散、非结构模型（均衡生长模型）假设培养体系是均一的，忽略细胞间的差异和不同时期组成及代谢特性的差异适于研究细胞群体代谢生长代谢规律离散非结构模型

培养体系中的细胞被区分成许多不同的状态和功能类型，对培养过程中细胞存在明显差异的系统是适合的。结构非离散模型

细胞被分散成多个不同功能的部分，各部分相互协调作用，对分析胞内代谢调控有应用价值。离散结构模型

细胞培养过程的实际情况，模拟单个细胞内的生化反应体系，通过单细胞模型的不同组合建立高层次的离散结构模型外源基因的表达和控制机制质粒的行为规律外界环境对工程菌生长和产物表达的综合影响研究内容外源基因的表达和控制机制

外源基因的表达由组成型基因或构建质粒时加入的Lac、Trp、Pl、Pr等启动子控制质粒的行为规律与宿主、质粒本身外界环境等密切相关工程菌培养过程中会发现质粒丢失现象，严重影响外源基因产物的产量和质量质粒的行为规律原

因分配的不稳定性结构不稳定性质粒不同拷贝状态分配不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。结构性不稳定：由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。质粒保持率

为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即表达效率及质粒拷贝数控制

在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。质粒行为动力学模型的建立意义

控制质粒的稳定性确定质粒的复制速率表达产物合成条件外界环境对工程菌生长及产物表达的综合影响工艺：多采用二阶段培养在一定时间内提高菌体浓度改变外界条件促使目的产物表达添加诱导物后基因工程菌的反应分类基本不变比生长速率受到冲击，适应一段时间后恢复到适当水平比生长速率单调下降基因工程菌发酵设备

机械搅拌发酵罐气升式发酵罐利用机械搅拌作用，使空气和搅拌液充分混合，促进氧的溶解和传递，满足微生物生长代谢对溶氧的需求原理：无菌压缩空气作为液体的提升力，使发酵液上下翻动实现混合和传质传热过程。优点：无机械搅拌机构最大限度的减少了染菌率，减少了机械剪切力，对长菌丝的各种真菌尤为适宜气体提升充分的气液混合使氧气的传递利用极大提高，特别适合高粘度培养基和对于溶氧要求高的产品。基因工程菌的高密度发酵和控制

培养基的选择培养方式的选择溶解氧的控制温度的影响及控制PH的影响及控制基因工程菌的发酵工艺中菌体的增殖和产物的表达均在对数期完成改进：延长对数期的生长时间、缩短衰亡时间高密度发酵工艺培养基的选择

发酵特点：工程菌在短时间内迅速分裂增殖，菌体密度迅速升高培养基影响：高浓度的碳源、氮源和无机盐造成溶液的渗透压过高，导致细胞脱水，抑制菌体生长，目的产物得率下降大量产生乙醇，抑制菌体浓度的进一步升高多采用分批补料培养，各种培养基浓度低于抑制浓度成分的选择选择容易被工程菌利用的营养物质浓度的选择浓度比普通培养基高2-3倍，但不能太高，会使发酵液渗透压增加，不利于工程菌的生长培养方式的选择

补料分批培养方法葡萄糖浓度反馈控制流加恒速流加指数流加溶解氧的控制

措施：增大搅拌转速和空气流量方法：提高通气中氧的分压在菌体中克隆具有提高氧传质能力VHb蛋白温度的影响及控制

生长和产物表达两个方面，分别维持不同的温度PH的影响及控制菌体生长和产物合成的PH控制在6.8-7.6较高的PH对产物的产量有促进作用基因工程菌发酵的后处理技术

细胞破碎蛋白质的浓缩与分离纯化核酸的分离纯化酚/氯仿抽提酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醇=25：24：1）。

1）使用注意酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。

2）安全操作酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。使用酚时应注意基因工程菌的不稳定性及对策

不稳定的表现不稳定的原因及对策质粒不稳定性表达产物的不稳定性原因培养基的组成组分通过各种途径影响稳定遗传培养温度低温有利于稳定