分子检验检测技术

分子检验检测技术课程讲义

一、分子诊断又称DNA诊断或基因诊断，是通过从生物体（比如疾病患者等）内提取样

本用基因检测方法来判断该生物体是否有基因异常或携带有其它不应该属于该生物体的生

物成份。

（检测物）病原1DNA加热退火（降温）是否杂交

（待检物）病原2DNA加热退火（降温）

注意：用于分子检测的器皿都需要消毒、灭菌

所用水必须是双蒸水、去离子水

二、分子检验检测的意义

随着社会经济的发展，国际国内贸易的日趋频繁，有害生物的扩散加速，动植物检疫

工作越来越受到重视，由于检疫性有害生物的扩散造成的各类问题备受关注。

实现对检疫性有害生物的快速检测是当前社会经济发展的迫切需求。

三、分子检验检测与传统检验检测方法的异同

传统检验检疫方法：耗时，专业要求高等等，主要是症状上判断：同症状，多病原，疑

难多，问题也多，耗时、耗材、耗力，对结果的准确性影响很大，且对专家的要求很高。

分子检验检测方法：快速，准确等等，直接从遗传物质入手，根据核酸序列来检测，既

准确又快速。DNA序列的独特性、专一性的检测标记进行鉴定。

四、分子探针，特异性

其特点：①三个相连核甘酸组成一个密码子，编码一个氨基酸，共有64个密码子。②

密码子之间无核甘酸间隔。③一种氨基酸可有多种密码子。④所有生物使用同一套密码子。

分子生物学的基础

一、几个简单的问题

1.分子生物学主要研究什么？

分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物

大分子的结构、组成和功能，以及它们在遗传信息和细胞信息传递中的作用等为研究对象，

是当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉和渗透的前沿领域；它包括：

a、研究核酸结构及其功能的核酸分子生物学；

b、研究蛋白质结构与功能的蛋白质分子生物学；

c、研究细胞信息传递与细胞信号传导的细胞分子生物学等。

2.核酸包括什么？

3.核甘酸是怎么连接的？

4.什么是一级结构？

5.二级结构是什么？

6.三级结构呢？

7.那么酶切是切什么？儿级结构？

8.RNA有几种？各有什么功能和特性？

二、核酸的理化性质

1.粘度2.紫外吸收3.沉降系数4.溶解性5.变性和复性

三、思考题

请简述生物体、细胞、染色体、蛋白质、核酸、基因等相互间的关系，并阐述分子检验

检测的目标对象。

三、分子诊断技术

概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是

否正常，从而对病害作出诊断的方法。

特点：针对性强、特异性高、灵敏度高、适用性强、诊断范围

四、分子诊断的常用技术方法

核酸分子杂交技术

1.限制性内切酶酶谱分析法

2.DNA限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析

3.等位基因特异寡核甘酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)杂交法

聚合酶链反应(PCR)

基因测序

基因芯片

动植物检疫的理想目标是：防止所有的检疫性有害生物(物质)，人为跨境(国家或地

区)传播，并及时地发现、限制或铲除外来的检疫性有害生物。

动植物病原物检验检疫技术是动植物检疫工作的重要组成部分，在动植物、动植物产品

及其他检疫物的装教容器、包装物，以及来自动植物疫区的运输工具中是否有有害生物，或

有害生物的种类与数量有多少，只有通过检测才能知道。动植物检验检疫的目的就是要发现、

检查和鉴定有害生物，以作为出证放行或作进一步检疫处理的依据。

检测检验是判断一个样品内是否存在特定目标病原物，而病害诊断是病害发生原因和性

质的鉴定。

检测检验技术要求快速、准确、灵敏、安全、高通量、简便、易于标准化和推广应用。

有害生物的传统检测鉴定，主要是从症状、形态鉴定、接种鉴别寄主、病原物培养性状

等方面来观察有害生物所表现的表型和性状来判断，受环境因素，人为因素等多种因素的影

响，往往影响对结果的准确判断。

此外，对于病害，许多传统的诊断程序一般都涉及到两个过程：第一，先要对病原物质

进行培养，培养后再分析它的生理生化特性；第二，确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、

细菌还是其他的物质。这种诊断方法成本高、速度慢、效率低。如果病原体生长特别慢或者

根本无法通过人工培养的方法获得，例如有些衣原体、植原体就不能培养或很难人工培养，

那么这种传统的诊断程序就很难有结果。

分子生物学研究表明，所有生命类型和不同物种差异的根源都是由遗传物质(DNA或

RNA)决定的，而遗传信息又是核酸上的核甘酸序列所决定的。因此最准确的检测鉴定方

法，就是测定一些基于核酸序列的分子生物学检测技术。

分子检测技术主要是指应用分子生物学的方法来对有害生物进行诊断检测鉴定。从理论

上讲，任何一个决定特定生物学特性的DNA序列都应该是独特的，都可以用作专一性的检

测标记，这就是分子诊断检测鉴定的理论基础。

不论是传统的常规检测，还是现代的分子技术，一种有效的检测方法都应该具备以下3

个条件：①专一性(specificity)强，这指的是检测只对目标分子或只对某一种有害生物分

子产生阳性反应；②灵敏度(sensitivity)高，是指即使只有微量的目标分子，或是在有很

多干扰存在的情况下，也能够很灵敏地检测出所寻找的那种有害生物的分子；③操作简单

(simplicity),主要是指在做大规模检测时，要求能够操作方便、简单、高效、廉价。

分类、鉴定、命名、诊断

分类(classification)分类的任务是解决从个别到一般或从具体到抽象的问题，亦即通

过收集大量有关个体描述的资料，经过科学的归纳，整理成一个科学的分类系统。理想的分

类系统应该是反映生物进化规律的自然分类系统。

鉴定(identification)鉴定的任务与分类恰恰相反，它是从一般到特殊或从抽象到具

体的过程，亦即通过详细的观察和描述一个未知名称纯种生物的各种性状特征，然后查找现

成的分类系统，以达到初类舞名的目的。将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，

确定其科学名称或分类上的地位。

命名(nomenclatuiv)命名的任务是为一个新发现的生物种确定一个新学名。亦即当你

详细观察和描述一个未知菌种后，经过认真查找现有的权威性分类手册，发现这是一个以往

还未记载过的新种，这时就得按微生物的国际命名法规给以一个新的学名。

诊断(diagnosis)从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。

DNA提取与测定及PCR

分子生物学基础

1、核酸的组成、结构与性质

核酸(nucleicacid)是体内重要的生物大分子，由于最初从细胞核分离出来，又具有酸性,

故称为核酸。

核酸的基本组成单位是核一

甘酸。L核音,一

DNA的基本组成单位是脱氧核

糖核甘酸。

RNA的基本组成单位是核糖核

甘酸。

r腺噤吟(A)]

噂吟T

I鸟喋吟(G)fDNA、RNA均有

碱基胞啕流(C),

｛胸腺啕症(T)-DNA有

尿嗑咤(U)-RNA有

1碱基

喋吟（purine）

腺喋吟鸟喋吟

（6-氨基喋吟）（6-氨基-2-氧喋吟）

喏咤(pyrimidine)

戊糖

构成RNA构成DNA

核昔：核昔=碱基+戌糖

连接方式：糖昔键噂吟环上的N-9或喀咤环上的N-1与糖的cr以糖昔键相连。

胞嗜咤脱氧核甘腺噂吟核昔

核甘酸

假若破

藉菩键

脱氧核甘酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

RNA和DNA中常见的核昔酸

碱基RNADNA

腺嗯吟腺嗯吟核甘酸（腺甘酸，AMP）腺嗓吟脱氧核甘酸（脱氧腺甘酸，dAMP）

鸟噂吟鸟噪吟核甘酸（鸟昔酸，GMP）鸟喋吟脱氧核甘酸（脱氧鸟甘酸，dGMP）

胞喀唬胞喀唬核昔酸（胞甘酸，CMP）胞嗑碇脱氧核甘酸（脱氧胞甘酸，dCMP）

尿啕定尿喳咤核昔酸（尿甘酸，UMP）

胸腺嗑咤胸腺啥咤脱氧核甘酸（脱氧胸昔酸，dTMP）

游离核甘酸及其衍生物

一磷酸腺昔（AMP）j

二磷酸腺昔（ADP））

Y

三磷酸腺昔（ATP）

多磷酸核甘酸

OHOH

3；5'-环化腺昔酸(cAMP)315。环化鸟甘酸（cGMP）

环化核甘酸:cAMP,cGMP

2.核酸的分类及生物功能

核糖核酸(RNA)：遗传信息的载体

核糖体RNA(rRNA):约占细胞中RNA总量的80%,是细胞质中核糖体的组成成分。

蛋白质合成场所，指导蛋白质合成。

转运RNACtRNA):约占全部RNA的15%,转运RNA是细胞中相对分子量最小的一

种RNA分子，以游离态存在于细胞质中。转运氨基酸。

信使RNA(mRNA):占细胞中RNA总量的5%左右。它是以DNA为模板，经转录

合成。转录遗传信息。

3.核酸的一级结构

核酸中核甘酸的排列顺序。由于核甘酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。

核甘酸之间以35一磷酸二酯键连接形成多核甘酸链，即核酸。

4.核酸的空间结构

a.DNA的双螺旋二级结构

DNA双螺旋模型的基本要点

1.两条链反向平行，围绕同一中心轴构成右手双螺旋。螺旋直径2nm,表面有大沟和

小沟。

2.磷酸-脱氧核糖骨架位于螺旋外侧，碱基垂直于螺旋轴而伸入内侧。每圈螺旋含10个

碱基对，螺距为3.4nm。

3.两条链通过碱基间的氢键相连，A对T有两个氢键，C对G有三个氢键，严格按照碱

基配对原则。

4.维持双螺旋稳定的因素：横向为氢键，纵向为碱基间的堆积力。

b.DNA的三级结构

DNA的三级结构指在二级结构的基础上，DNA双螺旋进一步卷曲所形成的闭合环状、

线状等超螺旋结构。

C.RNA的空间结构

单链RNA自行盘绕形成局部双螺旋区，在螺旋区，A与U配对，G与C配对。在3种

RNA中，目前，研究最清楚的是IRNA的空间结构，它的二级结构均为三叶草形，三级结

构呈倒L形。

核酸与核甘酸的主要性质及其应用

1.一般理化性质

核酸为多元酸，具有较强的酸性；DNA是线性高分子，粘度极大；

2.紫外吸收性质

在260nm波长有最大吸收峰，是由碱基的共舸双键决定。这一特性常用作核酸的定性、

定量分析。

3.核酸的变性、复性与杂交

■核酸的变性：在某些理化因素作用下(温度、酸碱、有机溶剂、尿素等)，核酸分子

互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构松散变成单链的过程。变性产生增色效应。

变性表征：

生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加(增色效应)

变性因素：

pH(>11.3或<5.0)变性剂(胭、甲酰胺、甲醛)低离子强度、加热

■核酸的复性：变性核酸在一定条件下如温度逐步恢复到生理范围内，两条互补链重

新恢复天然的双螺旋构象。

将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复

性即“退火”。退火温度=»11—25℃

复性影响因素：

片段浓度/片段大小/片段复杂性(重复序列数目)/溶液离子强度

复性特点：紫外吸收减少

减色效应：DNA复性过程中，紫外吸收减少的现象

常用的复性方法：退火

■杂交：不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同的核甘酸单链由于存在

包括：DNA—DNA杂交DNA—RNA杂交RNA—RNA杂交

原因：不同核酸的碱基之间可以形成碱基配对

用途：是分子生物学研究与基因工程操作的常用技术

核酸分子检测技术

核酸分子生物学自1953年Waston和Crick提出DNA双螺旋模型，标志着(核酸)分

子生物学的创立。随后，双螺旋结构创始人之一-的Crick于1958年提出分子遗传中心法则

(centraldogma),从而揭示了核酸与蛋白质的内在关系，以及RNA作为遗传信息传递者的

生物学功能以来发展迅速。进入20世纪70年代，随着限制性内切酶的发现和DNA杂交技

术的建立，核酸分子生物学进入技术化时代。之后，各种核酸分子生物学技术不断出现，概

括起来，主要包括核酸分子杂交(molecularhybridizationofnucleicacids)、聚合酶链式反应

(polymerasechainreaction,PCR)和DNA重组(recombinantDNA)技术等。

核酸的发现与早期研究

,1944年Avery等人证实DNA是遗传物质

•1953年Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构

•1985年Mullis发明PCR技术

•2001年美、英等国完成人类基因组计划基本框架

1978年Kan和Dozy首先应用羊水细胞DNA限制性片段长度多态性(restriction

fragmentlengthpolymorphism,RFLP)作镶刀状细胞贫血病的产前诊断，从而开创了DNA

诊断的新技术。二十多年来，DNA诊断技术取得了飞速的发展，建立了多种多样的检

测方法，这些检测方法已经广泛用于医学、农学、动植物检疫等各领域。

一、核酸的提取

核酸的分离与提纯是核酸研究中最基本的技术，分离获得的核酸质量的好坏直接关系到

实验的成败，但是不同的研究目的对核酸的纯度和量的要求不尽相同。

（-）分离提取核酸的方法

目前分离提取核酸的方法多种多样，概括起来，可以分为三大类：①通用方法，此方法

的适用范围较广，对一般的实验材料都适用。②针对某些特殊材料的方法，例如含多糖和多

酚类物质较多的植物材料，以及一些动植物蜡制标本材料和毛发与角质等材料，通常在提取

核酸的过程中，要采用一些适当的措施，消除多糖、多酚和角蛋白等的影响。③针对某个物

种或某一器官（或组织、细胞器）的方法，如针对某一物种例如棉花、甘薯等的特性，或某

•器官和组织例如动物的肝脏或肾脏等的特性，或某些细胞器例如叶绿体和核糖体的特性，

有一些专门的核酸提取方法。

（二）分离提纯核酸的基本要求

但是无论采用哪一种方法，一般而言，一个好的核酸的分离提纯方法都应该符合三个基

本要求：①所获得的核酸纯度应该能够满足下游操作的要求，例如用于核酸组成和结构分析

的材料，对纯度的要求很高，否则将可能影响分析结果，而时于用于PCR的核酸，通常纯

度要求不高，但是不得含有干扰PCR反应的污染物：②所得到的核酸应当完整，电泳检查

时可以给出精确性高、重复性好的迁移带型：③所得到的核酸应有足够的量。所以，根据实

验的要求和目的，常常有核酸大量提取方法和微量提取方法之分。

（三）核酸提取的基本过程

1.材料的准备与细胞的破碎

（1）材料的准备

由于实验目的不同，对于核酸提取材料的要求也不相同，①通常都要求材料新鲜无污染，

这里所说的新鲜是指对采集得到的样品应立即进行处理，对于暂时来不及处理的样品应该在

适当处理后冷藏保存。②应尽可能选择富含目的核酸的实验材料，如果对目的核酸的分布不

很清楚，也可以通过预备实验进行分析，还可以采取适当的措施增加实验材料中目的核酸的

含量，例如在提取质粒DNA时，可以先用氯霉素处理宿主细菌，从而使质粒的拷贝数显著

增加。③对于一些存在于特定细胞或细胞器中的核酸，应先分离富集这些细胞或细胞器，然

后再进行核酸的提取，例如要提取叶绿体或线粒体中的核酸，可以先采用超速离心的方法收

集叶绿体或线粒体，然后再进行核酸提取。

（2）细胞的破碎

在天然状态下，除了少数病毒的核酸不存在于细胞内外，其他核酸都存在于动物、植物

或微生物的细胞内，所以在提取核酸前首先要进行细胞的破碎。破碎细胞的方法很多，大体

上可以分为三大类，①机械破碎细胞，机械法破碎细胞通常适合于细胞壁比较坚固的植物细

胞和真菌细胞，最常用的手段是液氮冷冻研磨，即加人液氮使样品迅速冷冻，然后研磨破碎

细胞，有时也采用高速组织捣碎机、超声波和反复融冻等手段进行破碎。②化学法破碎细胞,

化学破碎法是采用一些化学试剂使细胞破碎，最常用的破碎细胞化学试剂是十二烷基磺酸钠

（SDS）和NaOH,另外，还有Tween-80和TritonX-100等,化学方法常用于动物细胞的破

碎和质粒DNA提取时破碎细菌细胞。③酶法破碎细胞，酶法是采用生物酶制剂破碎细胞的

方法，最常用的是在细菌细胞破碎中的溶菌酶。除了上述细胞破碎方法之外，还可以采用直

接加热等方法破碎细胞。上述方法可以单独使用，也可以联合起来使用，例如将溶菌酶和

SDS一起使用，能很好地破碎细菌细胞。另外，有些细胞破碎方法还兼有其他作用，例如

SDS和Tween-80等去污剂，除了能使细胞溶解破碎之外，还具有使蛋白质和核酸分离以及

抑制核糖核酸酶活性等作用。

2.核酸的提取和纯化

(1)蛋白质的沉淀

细胞破碎后，核酸和胞内的其他物质混合在一起，因此必须采用适当的措施使核酸从中

分离出来。对核酸分离纯化影响最大的是蛋白质，去除蛋白质的方法很多，常用的方法包括:

①使用SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、秦-1,5-二磺酸钠等去污剂使蛋白质与核酸分

离；②采用苯酚和氯仿使蛋白质沉淀；③采用某些蛋白酶使蛋白质降解，最常用的是蛋白酶

K和链霉蛋白酶。

(2)核酸酶的抑制

在核酸提取中，还要特别注意的是应采用适当的方法抑制或消除核酸酶的活性，以避免

核酸在提取过程中被分解。实际上，①上述各种蛋白质沉淀剂都是很好的核酸酶抑制剂，它

们在沉淀蛋白质的同时，也抑制了核酸酶的活性。②另外，在核酸的提取中，通常加入乙二

胺四乙酸(EDTA),它能够络合Mg2+和Ca2+等二价金属离子，从而抑制DNA酶的活性；

③也可以在核酸的提取过程中加入一些化学物质来抑制酶活性，例如异硫氟酸胭和3-筑基

乙醇都能很好地抑制RNA酶的活性。

(3)RNA与DNA的分离

去除了蛋白质等杂质后，接下来是如何将DNA和RNA进行分离。可以先将材料中的总

核酸沉淀分离出来，然后采用①RNA酶分解RNA就可以得到DNA,②也可以采用LiCl选

择性地沉淀DNA从而使RNA与DNA分开。③另外，可以利用DNA核蛋白能溶于水和高

浓度(例如1〜2mol/L。)的NaCl溶液而难溶于低浓度(例如0.14mol/L)的NaCl溶液,

而RNA核蛋白则易溶于低浓度(例如0.14mol/L)的NaCl溶液的特性，首先采用低浓度

NaCl溶液将RNA核蛋白从溶液中去除，然后采用SDS等使蛋白质变性沉淀，并用高浓度

的NaCl溶液溶解DNA,从而实现RNA与DNA的分离与纯化。

对于不同RNA(mRNA、tRNA、rRNA)的分离通常很不容易，可以先将细胞匀浆进行超

速离心，制得细胞核、线粒体和核糖体等细胞器，然后再分别从中提取不同类型的RNA。

对于真核生物的mRNA,由于在3,端有polyA尾巴，所以可以使其和固定化的寡聚脱氧胸

腺核甘酸［oligo(dT)］结合，从而选择性地分离纯化mRNA。另外，目前从动物组织和培养

细胞中提取完整总RNA普遍采用的方法是异硫鼠酸服法,异硫氟酸胭具有很强的抑制RNA

酶活性的能力，同时能很好地使蛋白质变性沉淀，经异硫氟酸呱提取的RNA可以直接用于

逆转录生成cDNAo

(4)核酸的浓缩

根据核酸溶于水而不溶于有机溶剂的特性，采用70%浓度的乙醇，就可以将核酸从溶

液中沉淀分离出来，从而实现核酸的浓缩，当然也可以采用其他有机溶剂沉淀、浓缩核酸。

3.核酸纯度的鉴定和定量分析

核酸在260nm处有最大吸收值，而蛋白质最大吸收值在280nm处。通过测定核酸溶液

260nm和280nm处的吸光值，并计算它们的比值，可以估计核酸的纯度，DNA纯品的

A260nm/A280nm比值为1.8,而RNA纯品的比值为2.0,如果样品中含有蛋白质和苯酚等

杂质，则两者的比值明显会低于上述值。

同样，利用核酸紫外吸收的特性可以进行定量分析。对纯品核酸，在260nm处的一个

吸光值单位相当于50ug/ml的双链DNA,37ug/ml的单链DNA或RNA,或者20ug/ml

的单链寡核甘酸。

对于核酸的分子质量大小和组成等，可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行分析和鉴定。

聚合酶链式反应PoIymerasechainreaction（PCR）

一、PCR的定义

在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。

二、PCR技术的优点

特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等能在一个试管内将所要研究

的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍

三、PCR原理

PCR是KaryMullis于1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程,即利用DNA聚合酶

（如TaqDNA聚合前）等在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外

扩增技术。

PCR技术原理

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物。模

板DNA变性：加热至940c左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火（复性）：

55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶

作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双

链；重复循环变性-退火-延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。

PCR通用操作程序

①配制反应体系，混匀后，离心数秒。

②PCR仪上设置程序，置反应管于PCR仪上，进行热循环（加矿物油50〜100口1于反应

液表面以防蒸发）

③琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

四、PCR的主要用途

（）目的基因的克隆

（二）基因的体外突变

（三）DNA和RNA的微量分析

（四）DNA序列测定

（五）基因突变分析

几种重要的PCR衍生技术

（-）反转录PCR

把RNA提取后反转录成cDNA,并以其为模板进行的PCR反应，通常用于检测某种

RNA是否被表达，或者比较其相对表达水平巢式PCR（nestedPCR）,是指利用两套PCR

引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，

此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降

低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；

又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。所以反转录-巢式PCR就是

以cDNA为模板进行的巢式PCR,它和简单的反转录PCR-样是用于检测某种RNA是否

被表达，或者比较其相对表达水平，但是特异性更高，可靠性更强。

（二）原位PCR（In-situPCR）

原位PCR是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然

后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。

五、PCR的标准反应体系

•10义扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物#200ymol/L

引物10〜100pmol

模板DNA0.1〜2ug

TaqDNA聚合酶（耐热聚合酶）2.5u

(Mg2+)1.5mmol/L

加双或三蒸水lOOul

反应体系对PCR扩增的影响

DNA模板

•纯度：蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应

•完整性：模板降解会导致PCR扩增无产物

•浓度：加量过多导致非特异性扩增增加

•特异性：长度适当、避免二级结构和二聚体

•完整性：避免反复冻融

•浓度：应适当，过高导致非特异性增加

六、PCR反应五要素

引物（primer）、酶（T叫DNApolymerase）、dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、模

板（template）、Mg2+（magnesium）

（一）引物

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度

引物设计的原则

①引物长度：15-30个碱基，常为20个碱基左右

②引物扩增跨度：以500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段

③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜,ATGC最好随机分布

④避免引物内部出现二级结构避免两引物间互补，特别是3'端

⑤引物3、端的碱基要求严格配对，特别是最末及倒数第二个碱基

⑥引物中可以加上合适的酶切位点要作酶切时加

⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性

（二）酶及其浓度

TaqDNA聚合酶

一个典型的PCR反应约需酶量2.5U,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合

成产物量减少

特异性：基因组扩增、RT-PCR

保真性：基因筛选、测序、基因克隆

长片段扩增：构建基因图谱、测序、分子遗传学

扩增效率：复杂模板扩增（GC含量高、二级结构）

PCR试剂盒：复杂模板扩增、大规模基因检测

（三）dNTP的质量与浓度

dNTP质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系

DdNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量分装，-20C冰冻保存。多次冻融会使

dNTP降解；

2）在PCR反应中，dNTP应为20~200umol/L,注意4种dNTP的浓度要相等;

3）dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低

（四）模板（template）

模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一。

（五）Mg?+浓度

1）Mg2+对扩增特异性和产量有显著影响：

Mg2+浓度过高，反应特异性降低；

浓度过低会降低ThqDNA聚合酶活性，使反应产物减少。

2）在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200Hmol/L时,Mg2+浓度为1.5〜2.0mmol/L

为宜；

七、PCR热循环条件的选择

（一）温度与时间的设置：

•设置变性-退火-延伸三个温度点：

1）93-95℃变性；

2）40-60C退火；

3）70-75℃延伸

•对于较短靶基因（长度为100〜300bp时）可采用二温度点法，一般采用94℃变性，65℃

左右退火与延伸

①变性温度与时间：

变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因，一般93℃〜94℃1min足以

使模板DNA变性；若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，高温环境对酶的活性有影

响。

②退火（复性）温度与时间：

退火温度是影响PCR特异性的较重要因素

变性后温度快速冷却至40℃〜60℃,可使引物和模板发生结合。

退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶片段的长度

引物的复性温度

当引物长度为15-20个碱基时一，在高离子强度中反应（如IMNaCl）

Tm=4（G+C）+2（A+T）复性温度=Tm值-（5-10℃）

复性时间一般为30〜60sec,足以使引物与模板之间完全结合

③延伸温度与时间：

延伸温度：一般选择在70〜75℃之间，常用温度为72℃

延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间Imin

延伸时间过长会导致非特异性扩增；对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些

（-）循环次数

・决定PCR扩增程度

•主要取决于模板DNA的浓度

・选在25〜40次之间

平台期与平台效应（plateaueffect）

PCR经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，

而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。

八、PCR反应特点

（-）特异性强

•靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。

•在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。

（二）灵敏度高

•PCR产物的生成量是以指数方式增加

•从100万个细胞中检出一个靶细胞，在细菌学中最小检出率为3个细菌

(三)简便、快速

•在DNA扩增仪中进行变性-退火-延伸反应，一般1〜3小时完成。

(三)对模板的纯度要求低

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA

或RNA扩增检测。

九、PCR常见问题与对策

PCR常见问题之一

•无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无；

•原因：模板:含有抑制物，含量低

,Buffer对样品不合适

•引物设计不当或者发生降解

•反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

•对策：纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

•更换Buffer或调整浓度

•重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换•管新引物

•降低退火温度、延长延伸时间

PCR常见问题之二

非特异性扩增现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，

或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

原因：引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度

偏低循环次数过多

对策：重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少

酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数

PCR常见问题之三

拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态

原因：模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高

循环次数过多

对策：纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用能适当降低dNTP和镁

离子的浓度减少循环次数

PCR常见问题之四

假阳性(筛选转基因、检测基因表达情况)

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

对策：1操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

2除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。离心管及枪头等均一次性使

用。

3各种试剂先进行分装，低温贮存。

四种策略

巢式PCR(Nest-PCR)、递减PCR(TouchDownPCR)>热启动PCR(HotStartPCR),使用

PCR增强剂

策略之一巢式PCR(Nest-PCR)

•巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列

很少。

A巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR

（如5'RACE）的特异性。

策略之二递减PCR（TouchDownPCR）

•递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比

估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低

于Tm5"C。

＞特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。

＞递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、

DNA指纹分析等。

策略之三热启动PCR（HotStartPCR）

•热启动主要是通过抑制•种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度；

•现在有很多公司都有HotStartT叫酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，

适合于高通量应用；

•热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一.

策略之四使用PCR增强剂

•甲酰胺，DMSO,甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。

•其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过

二级结构区。

＞增强剂浓度要适当

十、PCR污染

（-）污染原因

1模板间交叉污染2PCR试剂污染3实验室中克隆质粒的污染

（二）防止污染的方法

1合理分隔实验室2移液枪不能接触PCR相关试剂3手套、吸头、小离心管应一次性

使用4设阳性和阴性对照，重复实验

—、PCR技术的应用

•1基因组中特异片段克隆

•2反向PCR

•3不对称PCR

•4RT-PCR

•5基因的体外诱变

•6基因组的比较研究

核酸的分子杂交NucleicAcidHybridization

核酸分子杂交：

把同源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成

DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。

或是指同一生物个体非同一分子来源但具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核甘酸

链，通过碱基配对形成稳定的双链分子的过程。

五、DNA芯片技术

一、核酸分子杂交技术的原理

有互补特定核甘酸序列的单链DNA或RNA混在一起时;其相应同源区段将会退火形

成双链结构。

如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合适的标记物（如放射性同位素、生

物素等）予以标记，当作探针（probe）,在一定条件下，按碱基互补配对原则与变性后的互

补单链基因组DNA或RNA等进行杂交（变性）形成双链杂交体，鉴定靶序列的存在、分

子大小或进行靶序列的相对定量分析。

用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核

甘酸序列的拷贝数及表达丰度等。

应用：

1）检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；

2）用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。

二、核酸探针的制备

探针（Probe）：

一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核昔酸序列。

探针的制备方法

探针长度一般以50~300bp为宜。

制备方法：

1）利用DNA重组技术

2）PCR扩增

3）化学合成

探针的分类：

据制备方法及核酸性质不同，可分为：

1基因组DNA探针

2cDNA探针

3RNA探针

4寡核甘酸探针

注意的问题

•蛋白质电泳

•常用SDS

♦非变性PAGE

,Tris-Tricine胶中电泳

聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套

合成寡核甘酸探针注意原则：

1）长度（10-50bp）;

2）G:C对含量40%-60%：

3）探针内避免互补：

4）避免同一碱基连续出现；

5）与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。

三、核酸探针的标记

为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可

识别的信号。

1、标记的种类

同位素：

32P、35S、3H、1251等标记探针

非同位素：

生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物

两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。

一个理想的标记物：

1）标记前后探针的基本结构、化学性质相同；

2）特异性强、本底低、重复性好：

3）操作简单、节时；

4）安全、无环境污染。

2、探针的标记方法

（1）缺口平移法

（2）随机引物标记法

（3）末端标记法

（4）生物素光照标记法

缺口平移法的原理

将DNAaseI的水解活性与大肠杆菌DNApolymeraseI的5'f3'的聚合酶活性和5'

-3'的外切酶活性相结合。

首先用DNAaseI在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于Eco〃的DNApolI的

5'-3'外切酶活性，切去带有5'-磷酸的核甘酸；同时利用该酶5'-3'聚合酶活性，使生物素

或同位素标记的互补核甘酸补入缺口。

这两种活性同时作用，缺口不断向3'方向移动，DNA链上的核昔酸不断为标记的核普

酸取代，成为带有标记的DNA,纯化除去游离脱氧核甘酸后成为标记DNA探针。

随机引物标记法原理

用一些六核甘酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引

物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3'-0H

端添加标记的单核甘酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。

末端标记法原理

（1）一种是在5,末端加成标记法：

先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5'-磷酸，再用T4多核甘酸激酶催化标记的ATP转

移加到DNA片段5'-0H上。

（2）在探针3'-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTPo

生物素光照标记法

光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的

DNA探针。

四、核酸分子杂交技术

•将特定的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段（互补）就会退火形成

双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂

种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密

切；反之，其亲缘关系则比较疏远。因此，DNA/DNA的杂交作用，可以用来检测

特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系，而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可

被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

•在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛

细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印”上

去的，因此,核酸杂交也被称为"DNA印迹杂交"。由于该方法是E-M6outhern于1975

年首先设计出来的，所以又叫做Southernblotting。杂交中常用的滤膜有尼龙滤膜、

硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。

•核酸分子杂交包括两个步骤：第一，将样品转移到滤膜（卬迹转移）；第二，将滤膜

与DNA或RNA探针进行杂交。具体步骤：1、转移。2、在80℃下烘烤1〜2h或用

紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上。3、放入探针溶液中进行核酸杂

交。一旦与滤膜上的单链DNA杂交之后，就很难再解链。4、用漂洗法去掉没有杂

交上的探针分子。放射性同位素标记的探针可检测2ng；为了安全，我们用DIG（地

高辛）标记探针，荧光法检测杂交信号。

•基因组DNA被限制性内切酶酶切为DNA片段；各片段经电泳后在凝胶分为条带;

（c）中由下到上是：玻璃板、一层滤纸、凝胶、滤膜、很多层滤纸、玻璃板、重物。

通过毛细管作用将凝胶上的DNA条带原封不动地"吸印"到滤膜上去。（d）在80℃

下烘烤1〜2h或用紫外线交联法将DNA片段永久性地固定在滤膜上并形成单链。（e）

滤膜放入带标记的DNA或RNA核酸探针溶液中进行核酸杂交。

核甘酸序列分析

•仪器分析发展很快。

•如果将来做测序工作，有了分子生物学基础，就可以做。

•如果将来工作中需要测序，一般送到公司去测。

（一）Southern印迹杂交

此技术由Southern1975年首先设计。被检测对象为DNA。

（二）Northern印迹杂交

与Southern杂交类似。检测目的RNA的存在与否及含量。

（三）Western印迹杂交

将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体

-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。

（四）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交

适合于核酸样品的定性检测，而不是定量检测。

优点--简单、迅速；核酸粗提、多样品检测

缺点--不确定分子量、特异性不高，假阳性

（五）原位杂交

insituhybridization

又分为菌落杂交或噬菌斑、以及真核细胞原位杂交。

标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交。

1969.Pardue-爪蟾核糖体基因探针

1970,Orth一兔乳头状瘤病毒cDNA探针

•核酸原位杂交技术就是利用放射性或非放射性标记的已知核限探针,通过放射自显

影或非放射检测系统在组织、细胞及染色体上检测特异DNA或RNA序列的一种技

术，是一种直接、简便的研究基因定位和表达的方法。

原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因片段，

也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性同位素、非放射性

荧光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片

段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组DNA探针、寡核甘酸探针、RNA探针

等。

一、原位杂交的基本原理

•当溶液中的DNA分子经高温或高PH处理后，DNA双链分子会变性产生两条单链,

如果将温度逐渐下降或PH恢复到中性，单链会按照碱基互补配对的原则，重新形

成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只要它们之间的碱基顺

序同源互补或者部分同源互补，在条件适宜时，就可以全部或部分复性，产生分子

杂交。

,原位杂交技术包括有：菌落原位杂交(colonyinsituhybridization)>斑点杂交法(Dot

blot)>SouthernE|1迹杂交(Southernblot)>Northern印迹杂交(Northernblot)、

原位杂交(Tissueinsituhybridization)和基因组原位杂交(Genomeinsitu

hybridization)

•原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。它使它们的

研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的研究带来突破性的进展。

其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和发育生物学。

原位杂交技术主要步骤：

•材料处理及细胞样品的固定；

•样品的制备和预处理；

•探针的制备和预杂交；

•探针及样品的变性；

•杂交温育；

•检测杂交信号，进行结果分析。

染色体制片技术发展

•染色体制片主要包括三类：一是中期染色体制片，二是粗线期染色体制片，然后是

DNA纤维制片。

・中期染色体具有良好的形态结构，容易辨认，分辨率低，仅能达到l~3Mb,可检测

到的DNA序列间长度一般要求超过1Mb。

•粗线期的染色体的线性长度约为中期染色体的5~30倍，分辨率可达lOOkb,可识别

的DNA片段长度大于lOOkbo

•DNA纤维制备技术所产生的染色体纤维的分辨率接近游离态DNA双螺旋，实际实

验中可以达到几个kb。

玻片的处理

•原位杂交程序繁杂而且周期长，DNA更需要在玻片上表现出强有力的粘附性。

•常用的粘附剂有铭矶-明胶液、多聚赖氨酸溶液、VectorbandReagent粘附剂、

Tricholosilane(分子式为SiC13-(CH2)6-CH=CH2)、3-氨内基三乙氧基硅烷

(3-Aminopropyl-triethoxysilane,APES)

探针制备技术

•探针的制备主要采用缺刻平移法、随机引物法或者PCR扩增合成，对同位素标记探

针的方法还经常用到末端标记法。

•而探针的标记物分为同位素标记和非同位素标记两大类，前者标记物一般为3H、

35S或32P：,后者有生物素或地高辛的间接标记或者利用FITC或者罗丹明对探针

分子进行直接标记。

探针标记方法

•放射性标记有体内标记法及体外标记法。

•体外标记法不需要活体生物，所得探针放射性较高。故一般用体外标记法。体外标

记法有两种：化学法和酶法。

•化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应而进行标

记，标记物直接与核酸分子相连。

•酶法是先将标记物标记在核背酸上,然后再通过酶促聚合反应使带标记的核甘酸掺

入到核酸序列中，产生核酸探针。常用的有切口平移法、随机引物法、未端标记法。

切口平移法

•原理：DNA酶I在Mg2+离子存在时，能在双链DNA的各股单链的不同位置上造成

随机切口，然后在存在着一种已标记DNTP底物(如Dig-dUTP)的体系中用大肠杆

菌聚合酶I(poll)进行修复合成，在这个反应过程中将已标记的DNTP合成

进DNA链中。

切口平移法可对环状或线性双链DNA进行标记。一般对克隆的DNA片段用这种方法标

记的效果较好。

该方法使用时应注意：

A.只能标记双链DNA,使用探针时要预先变性后再使用，而且标记时DNA片段不太小；

B.DNA酶I使用的量要合适，太多会将DNA模板切碎，不能进行标记反应：太少则不能

有效地打开缺口，使标记物不能进入缺口；

C.标记时间不能太短，太短时间会造成标记量不足，影响杂交的进行。

随机引物合成法

•用一些随机引物和探针DNA片段一起加热变性，退火后，引物与单链DNA互补结

合，再在大肠杆菌聚合酶I的作用下，按碱基互补配对的原则不断在其3,端添加标

记的单核甘酸修补缺口，合成新的探针片段。

随机引物法是近几年来兴起的种有效的标记方法，可与PCR技术方法结合进行引物的

标记。此法对于较小的DNA片段也能很好地进行标记，一般对基因组DNA进行标记时用

这种方法的效果较好。

除此之外，该方法有如下一些优点：

A.模板的纯度不