2中药常用纯化技术

中药常用纯化方法的特点和选用中药开发研究所用各种方法得到的提取物是包含诸多成分的混合物，要想得到所需成分或单体化合物，须经反复分离精制。提取液一般体积较大，所含成分浓度较低，因此须对提取液通过蒸发或蒸馏进行浓缩，进行进一步的分离和精致。一、水提醇沉法二、醇提水沉法三、盐析法四、酸碱法五、透析法六、分馏法七、萃取法八、系统溶剂分离法目录含义：先以水为溶剂提取药材有效成分，再用不同浓度乙醇沉淀除去提取液中杂质的方法。原理：利用中药中的大多数成分易溶于水和醇的特性，用水提出，并将提取液浓缩，加入适当的乙醇或水反复数次沉降，除去其不溶解的物质，最后制得澄明的液体。一、水提醇沉法工艺依据通过水和不同浓度的乙醇交替处理可保留生物碱盐类、苷类、氨基酸、有机酸等有效成分。去除蛋白质、糊化淀粉、黏液质、油脂、脂溶性色素、树脂、树胶、部分糖类等杂质。①药材成分在水和乙醇中的溶解性。含醇量50%-60%

除淀粉、多糖等杂质

＞75%

除蛋白质等杂质

＞80%

除全部蛋白质、多糖、无机盐等杂质②根据工业生产的实际情况。水提醇沉法的操作要点

生产中：称重法

Cg/g%=0.7958×Cml/ml/[d+（0.7958-d)×Cml/ml]×100%d:醇沉温度下浓缩药液的密度加回收乙醇后：C４=C2V２/（Ｖ1＋Ｖ2）

χ=（Ｖ1＋Ｖ2）×（C３-C４）/（C1-C３）操作要点举例：取丹参饮片200ga煎煮2次：8～10倍水，浸泡30min，煎煮1h，纱布过滤――滤液1。药渣加6～8倍水，煎煮1h，纱布过滤――滤液2。b浓缩：滤液1＋滤液2――浓缩至100mLc第一次醇沉：加醇至含醇量70％，静置冷藏>2天过滤除杂质，滤液减压浓缩至40mL（1：5）。d第二次醇沉：加醇至含醇量85％，静置冷藏>2天过滤除杂质，减压浓缩至20mL（1：10）。△醇沉浓度要先低后高，有利于除杂质，减少杂质对有效成分的包裹，防止其一起沉出。△乙醇加入方法：要边加边搅拌。二、醇提水沉淀法先用适宜浓度的乙醇提取药材成分，再用水除去提取液中杂质的方法。适用于有效成分为醇溶性或在醇水中均有较好溶解性的药材。蛋白质粘液质多糖淀粉不提可提，但水中不溶可树脂油脂色素

常用方法：渗漉法、回流法。可保留生物碱盐类、苷类、有机酸等有效成分。去除脂溶性色素、树脂等杂质。含醇量40%-50%提取：强心苷、单宁、蒽醌及其苷、苦味质等60%-70%提取：苷类更高浓度乙醇提取：生物碱、挥发油、树脂、叶绿素等乙醇浓度的选择：杂质少、浓度高95%乙醇防止“串味”或混溶，造成污染配制适合浓度乙醇用量的计算（前面已讲）浓缩液相对密度的测定：通常：1:1特殊：1.20—1.25g/ml（50-60℃）醇沉的评判标准：具明显分界线、沉淀物呈板块状（好）无明显分界线、沉淀物呈稀糊状或蛋花状（不好）水提醇沉法和醇提水沉法注意事项三、盐析法含义：在含某些高分子物质的溶液中加入大量无机盐，使其溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的一种方法。主要适用于有效成分为蛋白质的药物的分离纯化。盐能使蛋白质分子表面的电荷被中和、蛋白质胶体的水化层脱水凝聚沉淀常用盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等三七的水提液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂苷乙即可沉淀析出。原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在萃取分离时，也往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取。四、酸碱法在溶液中加入适量酸或碱，调节pH值至一定范围，使单体成分溶解或析出，以达到分离的目的的方法。方法：酸溶碱沉法：生物碱加酸碱溶酸沉法：黄酮和香豆素类加碱等电点法：蛋白质（羧基和氨基）一些具有内酯结构的化合物遇热碱开环生成羧酸盐而溶于水，加酸后，又重新形成内酯环从溶液中析出。本分离法适用于酸或碱性成分，以及内酯类成分的分离。六、分馏法分馏法是利用各成分沸点的差异进行提取分离的方法，用于分离液体混合物。在天然药物有效成分研究中，挥发油及一些液体生物碱的分离常用此法。七、萃取（一）液液萃取溶剂萃取又称为液—液萃取，在中药研究中，萃取分离法主要用于有效成分的分离和富集。如果被萃取组分是有色化合物，则可以取有机相直接进行光度测定，这种方法称为萃取光度法。萃取光度法具有较高的灵敏度和选择性。杂质溶质原溶剂萃取剂LightphaseHeavyphase实验室液液萃取过程一般萃取3-4次即可液液萃取优点：溶剂萃取具有选择性好、回收率高、设备简单、操作简便、快速，以及易于实现自动控制等特点，因此一直受到广泛重视。缺点：费时费工，萃取溶剂易挥、易燃、有毒。应用：分配系数：利用成分在溶剂中溶解性能差异改变pH值：游离或成盐（生物碱、黄酮等）洗涤：极性溶剂—亲脂性溶剂，亲脂性溶剂-极性溶剂，去除杂质。萃取操作1简单萃取2.逆流连续萃取3.pH值梯度萃取法4.逆流分溶法5.液滴逆流分配法

1．简单萃取法

两相溶剂萃取法是分离天然药物化学成分的常用方法。少量样品的萃取用分液漏斗操作。

萃取的基本原理是利用混合物中各种成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的差异而达到分离的目的。

分配系数(Ｋ)可以下式表示：

Ｋ＝Ｃu/ＣL乳化现象

液--液萃取中常遇到乳化现象。产生的原因有：溶剂的组合、成分的种类等。操作中出现乳化现象，可采用下列破乳方法：

①久置；②用一金属丝在乳化层中搅动使之破坏；⑦将乳化层抽滤；④将乳化层热敷或冷冻；⑤分出乳化层，再用新溶剂萃取；⑥加少量氯化钠，解决两相比重相差较小及两相溶剂部分互溶的问题；⑦滴加数滴醇类如乙醇或磺化蓖麻油等破乳类物质2．逆流连续萃取法（二）固相萃取原理：选择性吸附和选择性洗脱的色谱分离原理。利用固相吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。分离：杂质保留或目标化合物保留。保留机制：被洗脱物与吸附剂表面的活性基团；化合物极性与吸附剂极性越接近，保留越强。分离机理：利用杂质或目标化合物与样品基体溶剂和吸附剂之间亲和力的相对大小（分子间作用力）。固相模式

1.反相萃取2.正相萃取3.离子交换萃取洗脱模式：取决于与固相的亲和力被洗脱物>溶剂（水、醇等），采用亲和力强于固相的溶剂洗脱。被洗脱物<溶解介质（水、醇等），直接被溶剂洗脱。有机溶剂非极性顺序：正己烷>环己烷>四氯化碳>甲苯>苯>无水乙醚>氯仿>二氯甲烷>四氢呋喃>乙酸乙酯>丙酮>乙腈>异丙醇>甲醇>水>乙酸1.反相萃取（Reversed-Phase)反相：吸附剂是非极性或弱极性的，如硅胶键合C18,C8,C4，C2,-苯基等.应用：可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。作用机理:非极性-非极性相互作用范德华力或色散力硅胶键合C18（ODS）ODS:octadecyl-silica(硅胶键合C18)ENVI-C18:键端封尾处理,去除硅胶表面残留的硅醇基,改善其对碱性或酸性化合物的吸附或拖尾.碳含量增大,对非极性化合物的保留容量增大.应用：中等极性到非极性化合物,如抗生素、咖啡因、药物、染料、芳香油、脂溶性维生素、杀菌剂、除草剂、农药、碳水化合物、苯酚、类固醇、表面活性剂、茶碱等洗脱溶剂：甲醇、乙腈、 丙酮及乙酸乙酯等HLB柱HLB:hydrophilic-lipophillicbalance，亲脂的二乙烯基苯和亲水的N-乙烯基吡咯烷酮按比例聚合和硅胶键合C18（ODS)比较：pH适用范围1-14柱子不怕抽干，碳链不会塌陷可以调节样品溶液的pH值来选择性的保留酸性、中性和碱性化合物。高保留性其他反相吸附剂C8：与C18相似，适合于非极性到中等极性的化合物，对非极性化和物的保留较C18稍弱。-苯基：与C8类似-C4：疏水性弱，适合于多肽和蛋白质的萃取。聚合物吸附剂：如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，用来保留含有亲水基团的疏水性物质，如芳香族化合物等。化合物的极性和吸附剂的极性越接近，产生的吸附越强。2.正相萃取(Normal-Phase)吸附剂：极性键合相，如硅胶键合－NH2、－CN，-Diol（二醇基）；极性吸附剂，如silica、florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等作用机理：1）极性-极性相互作用2）表面硅羟基、铝羟基与极性化合物的极性官能团之间相互作用，包括氢键，π-π键等。3）偶极-偶极相互作用4）偶极-诱导偶极相互作用应用：从非极性溶剂样品中吸附极性化合物硅胶柱(silica)氧化铝(Alumina)极性键合固定相-NH2（氨基）：较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力。a)正相萃取:适用非极性样品溶液中吸附极性化合物。b)弱阴离子交换萃取:适用于水溶液样品中碳水化合物、弱阴离子和有机酸化合物。-CN（氰基）：a)正相萃取：适用非极性样品溶液中吸附极性化合物，如酚类，类固醇、b)反相萃取：适用于水溶液样品中等极性的化合物。-Diol(二醇基):正相萃取，适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。形成氢键的强弱:-NH2>-CN>Diol正相或反相选择原则总目的：杂质和待分析物分离1、受样品基体提取溶剂，要分离的杂质和目标化合物的性质制约a)物质在柱上的保留（或洗脱）取决于其与吸附剂和样品基体溶剂（或洗脱溶剂）之间亲和力的相对大小。样品基体是强非极性溶剂，如正己烷，二氯甲烷等，一般要选用正相柱分离。样品基体是强极性溶剂，如水和甲醇，乙腈及丙酮的混合液，要选用反相柱分离。

3.离子交换分离法按键合的离子基团的性质分类：

阳离子交换柱 阴离子交换柱

按在水溶液中解离的程度：

强酸性(SCX,Strongcationexchange) 弱酸性(WCX,Weakcationexchange) 强碱性(SAX,Stronganionexchange) 弱碱性(WAX,Weakanionexchange)强酸性阳离子交换树脂指在交联结构高分子基体上带有磺酸基（－SO3H）的一类树脂反应式：R－SO3H+Na+R－SO3Na+H+在碱性、中性、甚至酸性介质都显示离子交换功能对强阳离子吸附较强,一般用一种含高浓度阳离子的洗脱液洗脱。对弱阳离子（弱碱离子）的吸附可以用一种碱溶液洗脱，中和弱阳离子的电荷。弱酸性阳离子交换树脂指含有羧酸基（－COOH）、磷酸基（－PO3H2）、酚基（－－OH）的离子交换树脂离解如下：R-COOHR-COO－＋H＋在接近中性和碱性介质中显示离子交换功能对强阳离子吸附可以通过酸性洗脱液中和硅胶表面的羧基而洗脱，或者用一种高浓度阳离子洗脱。对弱阳离子（弱碱离子）的洗脱可以用一种碱性洗脱液中和弱阳离子而洗脱，或用一种酸性洗脱液中和硅胶表面的羧基洗脱，或用一种高浓度的阳离子洗脱。强碱性阴离子交换树脂（SAX)所带来的功能团常见的碱性基团有：在水中解离：在酸性、中性、碱性解介质中都显示离子交换功能对强阴离子的吸附较强，难用调节洗脱液pH值洗脱，一般用一种高浓度阴离子洗脱。对弱阴离子（弱酸根离子）的吸附可以用一种酸性洗脱液来洗脱，中和弱阴离子。弱碱性阴离子交换树脂离子选择吸附顺序吸附：离子浓度相近时，电荷高，半径小的离子易被吸附。如下：强酸性Fe3+>Cr3+>Al3+>Ca2+>Mg2+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+弱酸性：H+>Fe3+>Cr3+>Al3+>Ca2+>Mg2+>>K+≈NH4+>Na+>Li+强碱性：Cr2O72->SO42->CrO42->NO3->Cl->OH->F->HCO3->HSiO3-弱碱性：OH->Cr2O72->SO42->CrO42->NO3->Cl->HCO3-离子洗脱顺序位于顺序前列的离子可以取代位于后列的离子高温高浓度时，处于顺序后列的离子可以取代位于前列的离子。（再生或洗脱）洗脱溶液可以是一种酸或碱，能中和待分析物所带电荷，或中和键合硅胶官能团所带电荷。注意：过柱前，需调节样品基体的pH值，使待分析物以离子状态存在。而且pH值要在离子交换柱的使用范围内。举例讨论若：一种化合物在水溶液中的Pka>4,可以用什么柱子在