代谢物识别与结构鉴定

关于代谢物识别与结构鉴定代谢物的结构鉴定在新药开发过程的重要地位预防潜在的毒性测定是否和原药具有相同的治疗作用测定对其他治疗有内在的活性测定是否有代谢物和已知药物相关第2页,共39页，2024年2月25日，星期天药物代谢研究贯穿于创新药物研发产业链的始终，并在药物的发现及开发过程中起到越来越重要的作用。建立可靠的分析方法是研究药物体内代谢的前提。在药物发现和开发的许多阶段，代谢物鉴定具有关键性作用。极性代谢物的分离和保留怎样在复杂的数据中准确快速地找到代谢物怎样对代谢物的结构进行确认，怎样确定代谢位点A

CB

第3页,共39页，2024年2月25日，星期天联用技术放射性示踪第4页,共39页，2024年2月25日，星期天一、.联用技术第5页,共39页，2024年2月25日，星期天联用技术LC-MSLC-MS/MSGC-MSGC-MS/MSLC-NMR第6页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS联用技术体内代谢物研究过程中，因待测物浓度太低，提取其纯品进行结构鉴定是不太可能的。应用LC-MS联用技术可获得复杂混合体中单一成分的质谱图，大大有利与药物代谢物的分离与鉴定。第7页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS联用技术随着现代色谱联用技术的发展，体内多种微量代谢产物的分离、鉴定已成为一个连续过程，尤其是LC-MS样品前处理简单，一般不要求水解或衍生化处理，可直接用于药物及其I，Ⅱ相等极性较大代谢产物的同时分离、鉴定。运用LC-MS技术不仅可避免复杂烦琐的分离、纯化代谢产物的工作，而且可分离鉴定难以辨识的体内痕量代谢产物。第8页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS联用技术

四极质谱仪（QMS）三重四极质谱仪（TQMS）四极-线性离子阱质谱仪（QTrap）四极-飞行时间质谱仪（Q-TOFMS）离子阱-飞行时间质谱仪（IT-TOFMS）代谢物鉴定中，常用的与LC联用的质谱仪器第9页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS特点样品前处理简单，无需衍生化，适用范围广将色谱的高分离能力与质谱的高检测灵敏度、定性专属性集于一身随着接口装置和离子化技术的发展成熟，该技术在体内药物分析中逐渐发展成为一种常规的分离检测方法第10页,共39页，2024年2月25日，星期天实例大鼠尿中人参皂苷Rd及其代谢物的LC-MS研究第11页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS实例目的：探讨人参皂苷Rd在大鼠体内的代谢产物及转化途径。方法：选择SD大鼠6只,单剂量口服和静脉给予人参皂苷Rd,分段收集给药前和给药后0～24h尿样,将尿样分时段合并后采用旋转薄膜蒸发浓缩,以固相萃取小柱纯化处理,采用高效液相色谱-串联飞行时间质谱进行检测。结果：通过比较给药前后的TOF总离子流图,对尿中推测的代谢物和标准物质的出峰时间及相关化合物选择离子扫描二级质谱图进行了比较分析,结果在尿中发现了

7种代谢产物

,系统分析了这些代谢产物的代谢转化规律及可能结构。结论：大鼠尿中人参皂苷Rd的主要转化途径为氧化、水解、结合及异构化代谢反应。第12页,共39页，2024年2月25日，星期天离子源(ESI)电压:-4kV,去簇电势(DP):-15V,聚焦电势(FP):-80V,去簇电势2(DP2):-15V,雾化气(NEB):0135L·min-1帘气(CUR):0120L·min-1负离子方式检测采用TOF扫描一级质谱扫描质量范围:400～1200选择离子扫描二级质谱进行测定色谱柱流动相其他质谱条件色谱与质谱条件为甲醇(A)-10mol·L-1乙酸铵(B)40min内由体积比50∶50线性梯度升至90∶10,40～55min维持A∶B=90∶10,等度洗脱15min流速:018mL·min-1分流比为1∶60柱温为25℃,进样量为20μLAgilentZorbaxSBC18(150mm×416mm,5μm)AgilentZorbaxSBC18(1215mm×211mm)预柱LC-MS实例第13页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS实例MetabolizationpathwayofG-Rd第14页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS实例FragmentpathwayofG-Rd第15页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS/MS联用技术由于多数药物的代谢物保留了原药分子的骨架结构，或一些亚结构，因此，代谢物可能进行与原药相似的裂解，丢失一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子，用MS/MS分别进行中性丢失扫描、母离子扫描以及子离子扫描，即可迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。第16页,共39页，2024年2月25日，星期天实例LC-MS/MS法快速高效检测尿液中尼古丁及其9种代谢物第17页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS/MS实例

以氘代尼古丁、氘代可的宁、3-OH-氘代可的宁、氘代尼古丁葡萄糖醛酸复合物、氘代可的宁葡萄糖醛酸复合物、3-OH-氘代可的宁葡萄糖醛酸复合物作内标,在LC-MS/MS的大气压化学电离(APCI)离子化模式下,建立了快速检测吸烟者尿液中尼古丁及其9种代谢物的方法,并对19个实际样品进行了测试和判别分析(DA).实验前处理简单,色谱运行时间仅为3.8min.结果表明,尼古丁及其代谢物的精密度在0.5%～5.5%之间,回收率在94%～109%之间,线性相关系数均大于0.995.DA分析充分区别开了不同量的吸烟者,进一步的相关性分析表明吸烟者24h尿液中的尼古丁及其9种代谢物含量与卷烟抽吸量的分析因子之间均有较强正相关性.第18页,共39页，2024年2月25日，星期天质谱检测采用APCI源正离子化模式气帘气压力设置为0.17MPa雾化气0.55MPa碰撞气0.04MPa离子源温度为550℃离子化电流设为3μA各代谢物的多反应监测(MRM)参数见表色谱柱流动相其他质谱条件色谱与质谱条件流动相A为10mmol/L醋酸铵水溶液(pH6.8)流动相B为10mmol/L醋酸铵的甲醇溶液流速0.5mL/min梯度洗脱条件:起始A为85%,到0.02min为5%保持至0.3min,0.32min变为85%保持至2min结束柱温为35℃为ShisheidoMGII柱(2.0mm×50mm,3μm)LC-MS/MS实例第19页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-MS/MS实例第20页,共39页，2024年2月25日，星期天GC-MS联用技术气质联用技术是分析仪器中较早实现联用技术的仪器。气相色谱分离效率高、定量准确，然而不足的是定性较为困难，及时未知样品纯度较高，鉴定结构也不容易。质谱具有灵敏度高、鉴别能力强、响应速度快的优点，但欠缺的是对复杂得多组分样品的分离能力。虽然商品化的GC-MS联用仪器出现较早，在药物代谢研究中的应用也较早，但GC法对样品的极性和热稳定性有一定要求。因此，在GC-MS联用技术分析前，样品的预处理极为重要。其代谢物的热稳定性、挥发性、极性可能差异较大，需要根据具体情况对样品先进行水解处理或衍生化处理。第21页,共39页，2024年2月25日，星期天实例GC-MS/MS法测定人头发中的大麻酚类及其代谢物第22页,共39页，2024年2月25日，星期天GC-MS/MS实例目的：建立同时检测头发中Δ9-四氢大麻酚（THC）、大麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和Δ9-四氢大麻酸（THC-COOH）的分析方法。方法：头发样品加入氘代内标Δ9-四氢大麻酸（THC-COOH-d3），经碱水解后，以混合溶剂[V（正己烷）∶V（乙酸乙酯＝9∶1]进行提取，吹干，残留物经双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，用GC-MS/MS方法进行分析。结果：头发中THC-COOH、THC、CBN和CBD的最低检出限分别为4、4、10和20pg·mg-1，各化合物在0.04～5ng·mg-1呈良好的线性关系（r＞0.999），方法精密度、准确度均符合要求。结论：本方法选择性强、灵敏度高，适用于头发中CBD、CBN、THC及其代谢物THC-COOH的分析，并成功应用于实际案例中。第23页,共39页，2024年2月25日，星期天质谱检测采用MRM模式，以一级质谱分析结果为基础，选择各目标物的分子离子，优化碰撞能量CE），得到各目标物和内标的二级质谱图。CBD、CBN、THC、THC-COOH

和THC-COOH-d3的MS/MS见表色谱柱柱温其他质谱条件色谱与质谱条件程序升温：100℃保持1.5min，以升温速率25℃/min升温至280℃保持5min分流比2∶1；载气：氦气进样口温度：250℃检测器温度：250℃进样量：1μL。HP-1MS石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.1μm）GC-MS/MS实例第24页,共39页，2024年2月25日，星期天GC-MS/MS实例第25页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-NMR联用技术近年来，LC-MS虽然得到普及推广，但MS本身不能提供足够的分子结构信息，因此在实际使用LC-MS鉴定药物代谢物结构时，往往需要借助核磁共振（NMR）的数据，才能顺利完成工作。目前，在仪器分析领域中NMR能够提供最大量的分子结构信息，但该法要求样品为纯品，即在做NMR分析前必须做大量的分离、纯化工作，这不利于样品的快速分析。如果在核磁共振仪器前配置一套色谱分离设备，使样品被LC分离后，直接进入NMR中进行扫描测定，就可以大大简化分析程序，提高样品分析速度。因此，将高分离能力的色谱与能提供最丰富结构信息的NMR在线联用是非常有意义的。第26页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-NMR联用技术但HPLC和NMR的联用并不是两种技术的简单组合：NMR的检测灵敏度明显低于常规的HPLC的检测器，且作为HPLC流动相的混合溶剂往往产生多重强溶剂峰而影响溶质峰的正确而检测。由于技术上的原因，如NMR灵敏度低、液相色谱使用的氘代溶剂十分昂贵，溶剂信号对样品的干扰等等使该联用技术受到限制。近年来LC/NMR联用技术在研究药物代谢产物,特别是Ⅱ相代谢产物方面表现出了非常诱人的前景,有关研究报告相继发表。第27页,共39页，2024年2月25日，星期天LC-NMR实例布洛芬在人体内代谢物的研究便是一个很好的例子,健康男性注射400mg布洛芬后,收集0～4小时的尿液,经HPLC/NMR联用技术分析,图谱中清晰地显示出5个代谢产物:2-羟基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羧基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羟基布洛芬、2-羧基布洛芬和布洛芬葡萄糖醛酸。采用停止流动模式技术可以得到纯的2-羟基布洛芬的1H-NMR图谱。第28页,共39页，2024年2月25日，星期天二、放射性示踪第29页,共39页，2024年2月25日，星期天放射性同位素示踪技术是利用放射性核素及其标记物作为示踪剂来研究生物体内各种物质吸收、分布、代谢、排泄(ADME)规律的一门科学。第30页,共39页，2024年2月25日，星期天放射性示踪原理把用放射性核素标记的物质A引入动物体，经过一段时间，从排出物或组织中分离出另一化合物B，含有相当数量的上述标记核素，即可确定A在动物体内可以转变为B.第31页,共39页，2024年2月25日，星期天与被示踪的物质有同一性，即放射性核素与其同种元素的非放射性核素在化学和生物学行为上具有高度一致性，不致扰乱和破坏体内外生理过程的平衡状态放射性示踪一与被示踪的物质有可区别性，放射性核素的原子核不断衰减，发出能被放射性探测仪所探测的射线，从而实现对标记物的定量及定位。二放射性同位素得以广泛应用于活性物质示踪主要依赖于其最重要的两个特点第32页,共39页，2024年2月25日，星期天放射性示踪灵敏度高专属性强适用性广检测方法简便在药物ADME研究中得到了广泛的应用。放射性同位素示踪技术在药物ADME研究中发挥着十分重要的作用，美国FDA已将放射性同位素标记药物给药后的药动学数据作为新药安全性评价的重要依据，并制定了相关指南第33页,共39页，2024年2月25日，星期天放射性同位素示踪剂的选择在药物ADME的研究中，常用的放射性同位素包括14C、3H、32P、33P、35S、125I、131I等。如今随着小型正电子发射断层扫描(positronemissiontomography，PET)仪器的发展，利用11C、13N、15O、18F等放射性核素进行ADME研究的实例也日渐增多。第34页,共39页，2024年2月25日，星期天放射性同位素示踪剂的选择放射性同位素YourTextHere实验目的操作者安全实验周期有时可以采用双标记或多标记的放射性物质单一放射性同位素标记的化合物毒性标记位置射