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文档简介
免疫组织化学实验1,免疫组织化学定义(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。2,原理
用标记的抗体(或抗原)对细胞或组织内的相应的抗原(或抗体)进行定性或定量检测,经组织化学的成色反应后用显微镜观察,进而检测出细胞或组织内与其结合的特异性抗原(或抗体)的表达状况。3.背景知识介绍抗原:能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答,并能与相应免疫应答产物(抗体或抗原受体)在体内外发生特异性结合的物质,多为蛋白质。抗体:能与相应抗原(表位)特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。抗原抗体反应:抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应4.IHC特点高度特异性:可以达到单个氨基酸水平敏感性:最大限度保存组织或细胞内待检物质的抗原性或增敏实验方法统一:一通百通形态、机能和代谢密切结合:
全方位了解抗原(或抗体)定性、定量和定位5,常用标记物--显色剂:荧光素:FITC(fluorescein
isothiocyanate,异硫氰酸荧光素)绿色RB200(rho-damine,四乙基罗丹明)明亮橙色TRITC(Tetramethyl
Rhodamine
Isothiocyanate,四甲基异硫氰酸罗丹明)橙红色酶:辣根过氧化物酶;碱性磷酸酶金属离子:铁蛋白金等:免疫电镜同位素:6.免疫酶染色方法:酶标抗体法通过共价键将酶结合在抗体上,制成酶标抗体,再借酶对底物的特异催化作用,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,以供光镜和电镜观察。
–优点:切片能长期保存、反复观察,适于镜下半定量分析。
–缺点:酶与抗体形成的共价键,可损害抗体和酶的活性;易产生非特异染色。直接法:将酶直接标记在一抗上,然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原-抗体-酶复合物,最后用底物显色剂显色。间接法:将酶标记在二抗上,先将一抗与相应的抗原结合,形成抗原抗体复合物,再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合,形成抗原-抗体-酶标抗体复合物,最后用底物显色剂显色。三种酶:HRP(辣根过氧化物酶);ALP(碱性磷酸酶);
GOD(葡萄糖氧
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