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文档简介

小鼠骨髓细胞的染色体制备

实验目的与要求掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。观察小白鼠染色体的形态特征和染色体数目,并验证实验小鼠的雌雄。实验原理秋水仙素可破坏骨髓细胞分裂过程中纺锤体的形成,把分裂的细胞阻截在中期,此时染色体达到最大收缩,具有典型的形态和特征。通过对小鼠骨髓细胞的低渗、滴片、染色等处理,可观察小鼠染色体。低渗使细胞膨胀,染色体松散;高空滴片时染色体进一步完全散开;再通过冷热处理;使细胞膜及核膜破裂。实验材料、器材和所需药品健康小白鼠(雌雄均可)、解剖刀、解剖盘、解剖剪、镊子、吸管注射器(5-10mL)、离心管(10mL)、烧杯(100mL)、37℃恒温水浴锅、普通离心机、显微镜、1:10的Giemsa磷酸盐缓冲液、秋水仙素(浓度为0.01%)、KCl(浓度为0.075mol/L)、生理盐水(浓度为0.85%)、固定液(甲醇:醋酸=3:1)、冰冻载玻片、吸管、量筒、酒精灯、吸水纸、擦镜纸实验步骤预处理→取股骨→冲洗骨髓→离心→低渗→离心→固定→离心→滴片→染色→观察

实验方法秋水仙素注射:选择健康的小白鼠(约20g重),在实验前约2-3h,按2-4ug/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素。断颈法处死小鼠。2、取股骨:用解剖剪刀剪取小鼠大腿骨,用剪刀剔除掉肌肉(尽量剔除干净!)。3、低渗:将剔除掉肌肉的2个腿骨放于培养皿(盛有预先于37℃温育的2mL的KCl溶液)中,用剪刀将腿骨剪碎(尽量剪得很碎!),然后低渗处理15min。4、将低渗后的上清液(不要骨头)倒入离心管,再加入1mL固定液,平衡后放入离心机,以1500r/min离心6min。5、第一次固定:弃上清,沉淀再加入3mL固定液,吹打匀,静置固定10min,平衡后放入离心机,以1500r/min离心6min。6、第二次固定:弃上清,再加入3mL固定液,吹打匀,静置固定10min,平衡后放入离心机,以1500r/min离心6min。7、制备细胞悬浮液:弃上清,将上清液倒尽,加入0.5mL固定液,用枪吹打开。8.滴片:用镊子取预先冰冻的干净载玻片,用吸管将溶液迅速滴上2-3滴细胞悬浮液,立即用另一载波片将溶液展开,使细胞分散均匀,然后晾干,或置酒精灯上微微加热干燥。共滴2张片。9、染色:将晾干后的载波片滴加染色液2-3滴覆盖样品、染色15min。10、染色后,水洗,凉干后即可镜检。。11、镜检:在低倍镜下找到中期分裂相的细胞,转用高倍镜,选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察。制备方法包括以下几个要点:

1.用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成,使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处。

2.用低渗法使将细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上。

3.空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。

五、注意事项

低渗与离心等步骤的操作要轻。

观察细胞的标准为:

1.细胞完整,轮廓清晰,染色体分布在同一水平面上。

2.染色体形态和分布良好。

3.最好无重叠,即使有个别重叠,也要能明确辩认,以免差错。

4.所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段,即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。

肿瘤细胞染色体制备与观察

实验原理、实验材料、器材和所需药品:见小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与分析实验实验方法1、肿瘤细胞株接种于小鼠腹腔,在实验前约3-4h,按2-4ug/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素。断颈法处死小鼠。2、收集肿瘤细胞腹水,倒入离心管内,稀释至50ml。3、取上述细胞液1ml,离心6分钟(1500r/min),收集沉淀物,弃去上清液。加低渗KCl处理15min。离心→低渗→离心→固定

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