牛结节性皮肤病的实验室诊断与防治

摘要：结节性皮肤病（LSD），是一种新兴的跨界病毒性痘病，影响所有年龄和品种的牛。是由山羊痘病毒属结节性皮肤病病毒(LumpySkinDiseaseVirus,LSDV)

引起的传染病,

牛和亚洲水牛均可感染，是牲畜的病毒性疾病，可引起皮肤和内部损害，影响牛奶产量，生皮质量，并可导致被感染动物死亡。采血液，使用实时聚合酶链反应（PCR）在实验室对死亡和怀疑感染的动物和牛的内脏或病变进行测试。对其可采取包括行动限制，病媒控制和疫苗接种在内的预防措施，以减缓疾病的传播。01病原病原是结节性皮肤病病毒（LSDV），属DNA病毒羊痘的痘病毒家族包括羊痘病毒（SPV），山羊痘病毒（GPV）和LSDV，具有97％的核苷酸同一性，并且在血清学上具有交叉保护作用。尽管Capripox的其他菌株感染绵羊和山羊，但LSDV与牛有关。LSDV以两种传染形式存在：具有单个外膜的成熟病毒体（MVS）和专门用于细胞间扩散的包膜病毒体（EV）具有附加膜。02简介宿主对LSDV感染的易感性受许多因素影响。CaPV感染的免疫主要是细胞介导的，因为大多数子代病毒仍保留在被感染的细胞内。通过在本地直接在细胞之间传播，该病毒不在循环抗体的范围内。通过从受感染细胞中萌芽释放的细胞外包膜病毒体，可能感染邻近细胞或逃逸到血液中，并在全身传播。LSDV的传播是通过蚊子，苍蝇和蜱。

已知对牛的LSDV感染具有天然抵抗力，并且亚临床LSDV感染很常见。LSDV造成重大的经济损失，主要是由于导致牛奶产量严重下降，体重减轻，流产，不育和生皮损害。为了成功地控制LSD，所有易感动物的疫苗接种被认为是主要支柱，并辅之以其他控制措施，例如扑灭，动物移动限制和媒介控制。03临床特征该疾病的特征是发烧、皮肤黏膜和内脏器官上的结节性病变。可能会出现牛奶产量减少，生皮受损，暂时或永久不育和受感染动物死亡的情况，从而在受影响的国家造成重大的经济后果。临床体征的严重程度取决于病毒的株系和被感染牛的品种。传播主要是通过叮咬昆虫的间接接触。LSDV的平均潜伏期为6～9d。该疾病的平均死亡率约为10％。04材料与方法动物和组织采样

从受影响的动物中收集生物标本。在实验室进行检测。从患病动物的脖子和头部收集结节性皮肤病变的皮肤刮擦5mL血样。尸检是对表现出与LSD一致的病死牛进行的。从这些动物中收集肺，肾，肝和心脏的一小部分进行测试。

制备样品，在提取DNA之前，将皮肤样品置于磷酸盐缓冲液（1XPBS）中1h。一块（约1.3cm2用剪刀将每个内部器官（肝，肾，心脏和肺）切成小块，并汇集在一起（总量不超过5g）。使用研钵和研棒，少量研磨加入8mL1×PBS的样品。将样品（皮肤或合并的内部器官）匀浆。匀浆后，将浆液倒入15mLEP中，并以8000rpm离心10min。将所得的上清液中提取DNA。试剂盒还可用于从血液样本中提取DNA。研钵和研棒之间用漂白剂消毒。

实验室检测

抗体检测：采集全血，分离血清用于抗体检测，可采用病毒中和试验、酶联免疫吸附试验等方法。

病毒中和试验

使用标准程序测试血清样本（n=80），该程序将中和指数确定为首选方法。针对恒定稀释的测试血清滴定病毒株。以此方式，需要更大体积的测试血清，但是消除了确保50％组织培养物感染剂量（TCID50）为100的困难。根据可用的OIE程序，使用羊睾丸（LTe）细胞在96孔板中进行测试。

病原检测：采集皮肤结痂、口鼻拭子、抗凝血等用于病原检测。病毒核酸检测可采用实时PCR等方法，病毒分离鉴定可采用细胞分离培养病毒，动物回归试验等方法。

实时PCR测试

内部器官样本进行检测。使用Taq聚合酶，10xPCR缓冲液，50mMMgCl2和10mMdNTPs制备PCR主混合物。将总共5μL提取的样品DNA或模板对照添加到15μL制备的预混液中，总体积为20μL。使用对应的热循环条件，在PCR仪器上进行反应。在样品测试之前，将阳性模板对照（PTC）从1pg/μL连续稀释至0.001fg/μL，并在PCR仪器上运行。合成循环阈值（CT）vs.PTC浓度曲线的对数给出3.76的斜率，对应于92％的扩增效率（每个循环100％加倍）。根据标准曲线，在后续测量中使用浓度为1fg