酶生物合成的基本理论

酶生物合成的基本理论第一篇酶的生产第二章酶生物合成的基本理论1第三章酶的生物合成法生产2第四章酶的提取与分离纯化3第2页,共61页，2024年2月25日，星期天第二章酶生物合成的基本理论引言1RNA的生物合成2蛋白质的生物合成3酶生物合成的调节4第3页,共61页，2024年2月25日，星期天酶的生物合成（enzymebiosynthesis）是通过细胞的生命活动合成各种酶的过程。细胞内酶的生物合成要经过一系列的步骤，需要诸多因素的参与，在复制、转录、翻译、加工和组装过程中，这些因素都对酶的生物合成起到调节控制作用。第4页,共61页，2024年2月25日，星期天第一节RNA的生物合成——转录中心法则Reversetranscription以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。第5页,共61页，2024年2月25日，星期天中心法则Replication复制：亲代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。Transcription转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则将其所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。Translation翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。Reversetranslation逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。第6页,共61页，2024年2月25日，星期天不同的RNA具有不同的生物学功能（1）双链RNA：在某些RNA病毒中，作为遗传信息的载体。（2）tRNA:

在蛋白质的生物合成过程中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；（3）催化活性RNA：属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。（4）sRNA：各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。（5）mRNA：携带遗传信息，在蛋白质合成时充当模板的RNA。（6）rRNA：是细胞中含量最多的RNA，约占RNA总量的82%。rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物合成的“装配机”。

第7页,共61页，2024年2月25日，星期天转录过程的特点转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。（反义链，有义链）反义链antisensestrand（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。有义链codingstrand（编码链，正链）：在RNA的转录中，不作为模板的DNA链称为有义链。第8页,共61页，2024年2月25日，星期天TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意义链反意义链RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPTTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’第9页,共61页，2024年2月25日，星期天转录过程的特点转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。

原核生物：核心酶，全酶（核心酶+σ因子）。

真核生物：RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，都属于寡聚酶，酶的亚基数目为4～10个，亚基种类有4～6种。第10页,共61页，2024年2月25日，星期天聚合酶种类RNA聚合酶ⅠRNA聚合酶ⅡRNA聚合酶Ⅲ别名rRNA聚合酶不均一rRNA聚合酶小分子rRNA聚合酶存在位置核仁核仁核质相对分子量550600600催化反应的产物rRNAmRNAtRNA，5SrRNA真核生物的RNA聚合酶第11页,共61页，2024年2月25日，星期天转录过程起始位点的识别recognition转录起始initiation链的延伸elongation转录终止termination转录后加工modification第12页,共61页，2024年2月25日，星期天RNA合成过程起始双链DNA局部解开磷酸二酯键形成终止阶段解链区到达基因终点延长阶段5

3

RNA

终止子(terminator)

启动子（promotor)5

RNA聚合酶

5

3

5

3

5

5

3

离开第13页,共61页，2024年2月25日，星期天转录的主要过程（以大肠杆菌为例）一、转录的起始1、全酶的形成：核心酶与ơ因子结合成为全酶。2、酶与模板结合：全酶与模板DNA结合生成不稳定的复合物，全酶可沿着模板DNA移动，寻找识别位点。3、酶与启动子结合：全酶与模板DNA的启动子结合生成酶与启动子的复合物。4、模板DNA局部变性：DNA的双螺旋部分解链。5、转录开始：全酶移至转录起始位点，生成稳定的酶-DNA复合物，按照碱基互补原则结合进一个核苷三磷酸，转录正式开始，ơ因子释放出来。第14页,共61页，2024年2月25日，星期天转录的主要过程（以大肠杆菌为例）二、RNA链的延伸1、从起始阶段到延伸阶段，RNA聚合酶分子的构象发生变化。2、RNA链的延伸沿着5’至3’的方向进行。延伸的速率大约为50nt/s.3、RNA聚合酶不具有外切核酸酶的活性，无校对功能，RNA生物合成的差错率为10-4-10-5，比DNA复制的差错率10-9-10-10大的多。第15页,共61页，2024年2月25日，星期天转录的主要过程（以大肠杆菌为例）三、RNA链合成的终止1、模板DNA分子上每一个基因或每一个操纵子都含有一个终止信号-终止子。2、有些RNA链合成的终止还需要终止因子（terminationfactor）-ρ因子的帮助。第16页,共61页，2024年2月25日，星期天转录的主要过程（以大肠杆菌为例）四、RNA前体的加工经过转录获得的产物并非成熟的RNA分子，而是RNA前体。（一）剪切反应：是指从RNA前体的末端切去一定大小的RNA片段，而得到成熟的RNA分子的加工过程。（二）剪接反应：是指将RNA前体的间插序列除去，并把两端的外显子连接起来，形成成熟RNA分子的加工过程。第17页,共61页，2024年2月25日，星期天转录的主要过程（以大肠杆菌为例）（三）末端连接反应：末端连接反应是指在RNA分子的3’末端或5’末端连接上特定的寡核苷酸，而形成成熟的RNA。1、在tRNA的3’末端加上CCA-OH2、在mRNA的5’末端形成‘帽子’结构。3、在mRNA的3’-末端连接polyA尾巴。4、在tRNA的5’末端加上甲基鸟苷酸。第18页,共61页，2024年2月25日，星期天转录的主要过程（以大肠杆菌为例）（四）核苷修饰反应成熟的tRNA分子中含有许多修饰核苷。这些修饰核苷是在tRNA加工过程中，通过各种酶的作用而生成的。第19页,共61页，2024年2月25日，星期天第二节蛋白质的生物合成——翻译定义以mRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖核蛋白体上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用，合成多肽链的过程。mRNA蛋白质翻译各种信息各种蛋白质（核苷酸排列顺序）（氨基酸排列顺序）第20页,共61页，2024年2月25日，星期天蛋白质合成的几个要素1、mRNA——模板mRNA是带有DNA遗传信息指导蛋白质合成的直接模板。以mRNA为模板，合成一定结构的多肽链的过程(翻译)，就是将mRNA分子中的核苷酸排列顺序转变成蛋白质分子中的氨基酸排列顺序。第21页,共61页，2024年2月25日，星期天2、遗传密码mRNA分子中,每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为密码子或三联密码。四种核苷酸编成三联体可形成43个即64个密码子。其中：一个起始密码:AUG三个终止密码:UAAUGAUAG多数氨基酸拥有:2-4个密码第22页,共61页，2024年2月25日，星期天3、转运RNA(tRNA)

tRNA是氨基酸的转运工具，携带活化的氨基酸到核蛋白体。tRNA有特异性，至少有20种以上。每种tRNA的反密码环顶端均由三个核苷酸组成的反密码，能与mRNA上相应的密码互补结合。第23页,共61页，2024年2月25日，星期天酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密码mRNA密码(codon)与反密码(anticodon)的碱基配对第24页,共61页，2024年2月25日，星期天4、核糖体核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和rRNA组成。是存在于细胞质内的微小颗粒。第25页,共61页，2024年2月25日，星期天Theribosomecompositionofprokaryoticandeukaryoticcell第26页,共61页，2024年2月25日，星期天5、其他因子和酶其他辅助因子工具酶第27页,共61页，2024年2月25日，星期天一、遗传密码（一）遗传密码的概念（二）遗传密码的特点1、遗传密码的简并性：一种氨基酸具有一个以上的密码子的现象称为简并性。2、遗传密码的通用性：不管在体内还是体外，不管是何种生物，遗传密码子都是通用的。3、密码子和反密码子的相互作用第28页,共61页，2024年2月25日，星期天三联体密码第29页,共61页，2024年2月25日，星期天第30页,共61页，2024年2月25日，星期天二、蛋白质的生物合成氨基酸的活化肽链合成的起始肽链的延伸肽链合成的终止与释放大肠杆菌在核糖体上合成多肽第31页,共61页，2024年2月25日，星期天（一）氨基酸活化生成氨酰-tRNAAA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶AA-tRNA+AMP+PPi对于真核生物，肽链合成时的第一个氨基酸是甲硫氨酸（Met），起始tRNA是Met-tRNAMet。而对于E.coli而言，肽链合成时的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet)，起始tRNA是fMet-tRNAF。第32页,共61页，2024年2月25日，星期天（二）肽链合成的起始1、30s亚基与起始因子IF3结合；2、30s亚基与mRNA结合，形成30S-IF3-mRNA复合物；3、fMet-tRNAF与起始因子IF2以及GPT结合，生成fMet-tRNAF-IF2-GPT；

4、在起始因子IF1的参与下，30S-IF3-mRNA与fMet-tRNA-IF2-GTP结合生成30s起始复合物。在此复合物中，fMet-tRNAF上的密码子正好与mRNA的起始密码子（AUG）结合。5、50S亚基与30S起始复合物结合，形成70S核糖体。fMet-tRNAF位于70S核糖体的“P”位（肽酰基位），而它的“A”位（氨酰基位）是空位。第33页,共61页，2024年2月25日，星期天AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亚基mRNAfMet-tRNAFGTP大亚基GDP+PiA位P位fMetfMet肽链合成的起始阶段第34页,共61页，2024年2月25日，星期天（三）肽链的延伸1、延伸因子EF-T与氨酰-tRNA以及GTP结合生成复合物。2、进位:氨酰-tRNA进入核糖体上的A位（受位）;3、转肽:形成肽键，在转肽酶作用下,给位与受位结合;4、移位:核蛋白体向3’端移动一个密码子的位置，空出受位，不断地进位、转肽、移位，使肽链延长。第35页,共61页，2024年2月25日，星期天AUGACA5’3’UACfMet苏UGUAUGACA5’UACfMet苏UGUGUUAUGACA5’UACfMet苏UGUGUUAUGACA5’fMet苏UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始复合体进位转肽移位Mg+K+肽链合成的延伸阶段第36页,共61页，2024年2月25日，星期天进位移位转肽第37页,共61页，2024年2月25日，星期天（四）肽链合成的终止阶段出现终止密码并与终止因子结合;肽键水解，多肽释放;tRNA，mRNA，大小亚基解离。第38页,共61页，2024年2月25日，星期天AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’终终AUGUAA5’UAC3’终5’3’UAC终肽链第39页,共61页，2024年2月25日，星期天（五）蛋白质前体的加工1、N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸的切除2、二硫键的形成与重排3、肽链的剪切4、氨基酸侧链的修饰5、肽链的折叠（分子伴侣、折叠酶）6、亚基的聚合第40页,共61页，2024年2月25日，星期天第三节酶生物合成的调节第41页,共61页，2024年2月25日，星期天ABEX底物水平的调节酶水平的调节酶活性的调节酶含量的调节酶的定位调节辅助因子调节生长发育的不同时期外界环境变化酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）产物调节细胞内酶的调控模式第42页,共61页，2024年2月25日，星期天酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量是由特殊的基因信息决定的。DNA所携带的酶蛋白遗传信息，需要通过转录和翻译而合成酶蛋白。在细胞内进行的转录或翻译过程都有特定的调节控制机制，其中转录的调控占主导地位。因此，基因表达的调控主要在转录水平上进行。第43页,共61页，2024年2月25日，星期天组成酶：在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大。如：DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。

适应酶（调节酶）：在细胞中的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如：大肠杆菌β-半乳糖苷酶。第44页,共61页，2024年2月25日，星期天一、原核生物中酶生物合成的调节控制与酶生物合成有关的基因调节基因启动基因操纵基因结构基因第45页,共61页，2024年2月25日，星期天

调节基因(regulatorgene)：

可产生一种组成型调节蛋白(regulatoryprotein)

（阻遏），通过与效应物(effector)（包括诱导物和阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。第46页,共61页，2024年2月25日，星期天启动基因（promotorgene）：

RNA聚合酶的结合位点

cAMP-CAP的结合位点CAP：分解代谢产物活化蛋白，又称环腺苷酸受体蛋白。只有cAMP-CAP复合物结合到启动子的位点上，RNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才能开始。两个位点第47页,共61页，2024年2月25日，星期天操纵基因（Operatergene）:

位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（Structuralgene）:

决定某一多肽的DNA模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNA，再翻译为蛋白质。第48页,共61页，2024年2月25日，星期天操纵子：由结构基因、操纵基因和启动基因一起组成。诱导型操纵子：无诱导物的情况下，其基因的表达水平很低或不表达，只有在诱导物存在的情况下，才能转录生成mRNA，进而合成酶。例：乳糖操纵子阻遏型操纵子：在无阻遏物的情况下，基因正常表达，当有阻遏物存在时，转录受到阻遏。例：色氨酸操纵子第49页,共61页，2024年2月25日，星期天1、分解代谢物阻遏作用某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶生物合成的现象。葡萄糖等物质分解代谢释放能量ATP↑AMP↓细胞内的cAMP通过磷酸二酯酶水解生成AMP腺苷酸环化酶活化受到抑制cAMP的生成受阻胞内cAMP↓cAMP-CAP复合物↓启动基因位点上没有足够的cAMP-CAP复合物RNA聚合酶无法结合在启动基因位点上转录无法进行，酶合成受阻第50页,共61页，2024年2月25日，星期天分解代谢物阻遏作用细胞生长、新陈代谢进行ATP↓ADP↑、AMP↑、cAMP↑cAMP-CAP复合物结合到启动基因的特定位点RNA聚合酶结合到相应位点酶生物合成开始为了减少或解除分解代谢物阻遏作用，可以在培养环境中控制好某些容易降解物质的量或添加一定量的cAMP。第51页,共61页，2024年2月25日，星期天2、酶生物合成的诱导作用

加入某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象。诱导物：能引起诱导作用的物质，一般是酶催化作用的底物或底物类似物。已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；

-半乳糖苷透过酶；

-半乳糖乙酰化酶。实验：

1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；

2.大肠杆菌生长在乳糖唯一碳源乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；当换成葡萄糖培养基时，三种酶基本消失；

3.表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。第52页,共61页，2024年2月25日，星期天调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAA、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导

乳糖阻遏蛋白（有活性）诱导第53页,共61页，2024年2月25日，星期天3、酶生物合成的反馈阻遏作用酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。共阻遏物：引起反馈作用的物质实验：

（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。第54页,共61页，2024年2月25日，星期天调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达色氨酸操纵子（酶的阻遏）第55页,共61页，2024年2月25日，星期天二、真核生物酶生物合成的调节