宏基因组学的研究

宏基因组学研究进展及其应用摘要：本文先简要介绍了当前生物化学的一些研究热点，再针对宏基因组学展开论述，介绍了宏基因组学的产生背景和概念，当前的研究进展及应用。宏基因组学尝试通过免培方法获得微生物的纯培养，主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选，可用于开发新型酶、发现新基因、筛选医药等方面。关键字：宏基因组学；宏基因组学基本策略；文库构建与筛选；宏基因组学研究进展及其应用引言：微生物是地球上种类最多、数量最大、分布最广的生物群。仅原核生物(细菌和古细菌)即构成地球生物总量的的25～50%[1]。自然条件下，包括病毒在内的微生物,通过群落广泛参与C、N、O和S等重要元素的循环转化，在人体的食物消化、毒素降解及机体免疫反应，环境污染物降解等方面发挥着重要作用[2]。人们对于微生物的研究主要是建立在纯培养基础上，后来人们发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性只占总量的0.1%~1%[3]，多达99%以上的微生物是不可培养的,其中蕴含着巨大的应用潜能——其代谢产物中可能有众多具有应用开发价值的化合物[4]。为了研究不能培养的微生物，一个全新的理念——宏基因组学应运而生，该技术不需预先培养就能开发这些微生物基因组，目前已广泛应用于微生物活性物质的开发与利用、环境微生物种群分布及动态变化分析等方面的研究[5]。宏基因组学的提出为解决上述问题提供了一个可行途径。宏基因组学以生境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物。由于突破了传统研究领域无法涵盖不可培养微生物的瓶颈，宏基因组学概念及研究方法一经提出，就被广泛接受。尽管在方法上还存在一定缺陷，但并不妨碍不同领域学者利用该方法来研究各种生境中微生物生态以及筛选功能基因的热情，有关宏基因组学研究的文章逐年增多[4]。宏基因组学的概念宏基因组(metagenome)的概念是指从生境样本中取得全部微生物的基因组,而不是采用传统的培养微生物的基因组。宏基因组的样本既包括可培养的微生物，也包括更大量的传统方法无法研究的不可培养微生物[6]。而所谓宏基因组学(也称元基因组学Metagenomics、微生物环境基因组学MicrobialEnvironmentalGenomics、生态基因组学Ecogenomics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、构建文库和功能分析筛选等工作[7]。宏基因组学的基本策略及方法2.1宏基因组学的基本策略宏基因组学的研究还处于初期发展阶段，但其研究的基本过程和基本策略已基本清楚。在此要强调的是，宏基因组学研究有着明确的指导思想，它是在反向生物学原则指导下，基于特定生态环境基础上，依据整体、系统、动态变化和相互作用的观点，运用特殊的技术路线和方法，对研究范围中所有基因组展开研究的学科。
宏基因组学是一种整体性的研究策略，它建立在微生物基因组学的迅速发展和聚合酶链式反应广泛应用的基础之上，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术，涵盖了生物信息统计分析和基因组两方面的意义和技术，其策略是从特定环境中直接分离所有微生物DNA，将大片段的DNA克隆到受体菌中表达，然后根据某些生物活性筛选有应用价值的克隆。[8]2.2宏基因组学研究的基本方法宏基因组学以基因组技术为基础，基本程序包括：环境样品中宏基因组的提取，将DNA克隆到载体中;载体转化宿主细菌建立环境基因组文库，环境基因组文库分析和筛选。近年来，随着新一代高通量、低成本测序仪的问世，宏基因组的研究可对特定生境中的基因组片段直接进行测序而不用构建文库，从而避免了在文库构建过程中利用细菌对样品进行克隆以及克隆中引起的偏差，简化了宏基因组研究的基本操作，提高了测序效率，极大地促进了宏基因组学发展[9]。2.2.1宏基因组DNA的提取环境样品DNA的提取是文库构建中最重要、最关键的一步，不仅要尽可能地将环境中所有微生物的DNA提取出来，还要保证一定的DNA片段长度和完整性。另外，环境样品中都含有一定的杂质(如土壤中的腐殖酸类物质)，这些物质可抑制分子克隆中多种酶的活性，因此必须将其除去[10]。目的样品的采集须严格遵循取样规则，使样品能最好地代表自然状态下的微生物状态[9]。根据提取宏基因组前是否分离细胞，提取方法可分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法主要是通过去污剂处理(如SDS)，酶解法(如蛋白酶K)等直接破碎样品中的微生物而使DNA得以释放。由于无须对样品微生物进行复性，且黏附于颗粒上的微生物细胞亦能被裂解，原位裂解所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性，且操作简单，成本低，DNA提取率高。但该法提取的DNA片段较小(1～50kb)，通常适用于构建小片段文库的DNA提取[11]。异位裂解法先用物理方法将微生物从样品中分离出来，然后采用较温和的方法抽提DNA，可获得纯度较高的大片段DNA(20～500kb)，但该法操作繁琐，一些微生物基因组在分离过程中可能丢失，温和条件下一些细胞壁较厚的微生物DNA抽提不出来，提取率较低且成本高，通常适用于构建大片段插入文库的DNA提取[12]。2.2.2宏基因组文库构建与筛选宏基因组文库的构建沿用了分子克隆的基本原理和技术方法，并根据具体环境样品的特点和建库目的采取了一些特殊的步骤和策略。构建宏基因组文库的技术主要包括：提取和纯化环境微生物DNA、选取合适的克隆载体以及选择宿主菌株。基本原则是以分离独立基因或者一些编码新代谢功能的小操纵子为目的时，以小插入片段载体(如质粒)构建文库，提取和纯化DNA时只需考虑纯度和物种的丰度[13]；而大插入片段文库(如Cosmid、Fosmid或者BAC)适合于获取编码复杂生物合成途径的大基因片段或者基因簇，但是构建这种文库需要提取和纯化更高长度和纯度质量要求的DNA。2.2.2.1载体选择DNA提取后就可以构建文库。在文库构建过程中，载体是文库构建所必需的因素,而且在