逆转录聚合酶链反应中的细节问题

逆转录聚合酶链反应中的细节问题RT-PCR原理第2页,共45页，2024年2月25日，星期天实验器具与材料试剂

标本收集与保存

RNA抽提逆转录反应(RT)聚合酶链反应（PCR)介绍内容第3页,共45页，2024年2月25日，星期天一、实验器具、材料1、移液枪：1ml、200μl、20μl

2、吸头及吸头盒：1ml、200μl、20μl（无菌无酶，可直接购买）

3、EP管：1.5ml（无菌无酶，可直接购买）4、PCR薄壁管0.2ml

5、普通EP管：1.5ml、O.5ml（高压灭菌）

6、大瓷缸：2个（180℃的高温干烤6h，灭活RNA酶，存放无酶EP管和PCR管）

7、组织捣碎棒（可直接购买）第4页,共45页，2024年2月25日，星期天1、DEPC水500ml。

2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放4℃保存

3、异丙醇

4、氯仿

5、电泳缓冲液(TAE/TBE)

7、琼脂糖

8、Taq酶（含MgCl2Buffer）,-20℃

9、dNTP,-20℃

10、随机引物,-20℃

11、M-MLV逆转录酶(Buffer),-20℃

12、RNasin,-20℃

13、Trizol100ml/1瓶,-4℃

14、Marker,-20℃

15、引物,-20℃

二、试剂第5页,共45页，2024年2月25日，星期天三、标本收集与保存

1、细胞：悬浮细胞：1500rpm,5min离心，取沉淀-80℃冻存，或直接抽RNA;

贴壁细胞：倒掉培养液，加Trizol1ml,溶解细胞，直接抽RNA或冻存（如没有Trizol，可用胰酶消化后，同悬浮细胞处理）2、组织：液氮取材（越快越好），-80℃冻存：即可用于抽RNA,也可用于抽蛋白；

RNA保护剂取材:用普通冰袋即可，但不宜用于抽蛋白；

Trizol取材：同上；

-80℃冰袋取材：没办法的办法。

目的：防止RNA被RNA酶降解措施：低温、RNA酶抑制剂、尽快取材防止细胞裂解第6页,共45页，2024年2月25日，星期天四、RNA抽提

目的：防止RNA被RNA酶降解，获得高质量的RNA措施：1.了解RNA酶的来源及应对方法：（1）内源性：组织细胞裂解释放（低温、RNA酶抑制剂）（2）外源性：实验者的皮肤分泌物、呼吸气体、唾液等（带手套、口罩）；（3）实验环境中的灰尘、微生物等（环境清洁、消毒、在超净台内进行）；（4）实验器械（进行无酶处理）：180℃的高温下干烤6h；0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具不能使用）；用DEPC处理过的无菌双蒸水配制溶液。第7页,共45页，2024年2月25日，星期天2、了解RNA抽提的步骤原理，知道哪些是需要注意RNA酶污染的关键步骤，做到胆大心细。举例如下：TRIREAGENT分离RNA

PROTOCOL1）5～10×106细胞沉淀，加TRIReagent1ml,反复吹打将细胞溶解。

50-100mg组织加1mlTRIReagent于匀浆器中匀浆（注意：标本体积不得超过TRIReagent体积的10%）2）将匀浆于室温静置5分钟（此步后将样本置-80℃至少可保存一个月）3）然后向匀浆中加入0.2ml氯仿,盖紧样本剧烈振摇15秒4）将混合物室温静置2-15min，12,000g，4℃离心15min（低温离心很重要，否则，水相中会混入少量的DNA）(离心后原混合物分为底层红色的酚－氯仿相,中间相和上层无色的水相。RNA存在于水相，而DNA和蛋白质分别存在于中间相和有机相。水相的体积大概占用于匀浆的TRIReagent总体积的60%。)5)转移上层无色的水相至新的管子中,加0.5ml异丙醇（从水相中沉淀RNA），室温静置5-10分钟6)12,000g，4℃离心8min.此时可见RNA沉淀(离心前通常看不见)于管底或侧壁形成胶冻状或白色沉淀。第8页,共45页，2024年2月25日，星期天7)移去上清，加至少1ml的75%乙醇洗涤RNA沉淀(用涡旋)，（此时RNA可至于75%乙醇中存于4℃至少一周或存于-20℃至少一年）8)然后于7,500g，4℃离心5min（如

RNA沉淀积于管壁一侧和倾向于漂浮，于12,000g沉淀）9)移去上层的乙醇洗液，将RNA沉淀置空气中短时干燥.（注意不要让RNA沉淀完全干燥，因为这样将极大的降低其可溶性。但对于用于RT-PCR的样本而言，应尽量让RNA样本中的乙醇挥发，这对5-20微升的小体积样本尤其重要）

10)用30-50mlRNase-free的水溶解RNA几分钟，可用吸头吹几下（如还不溶于55-60℃孵育10-15分钟）11)浓度质量检测所需试剂：TRIReagent（MolecularResearchCenter,INC.，Cat.No.TR118）RNase-free的水（上海生工Cat.No：D1005－100ml）氯仿、异丙醇、乙醇所需器材：组织捣碎棒（RNase-free，上海华舜Cat.No：W1220）RNase-free，1.5ml离心管1ml，200微升、20微升tip（RNase-free，已消毒盒装)第9页,共45页，2024年2月25日，星期天3、RNA质量检测1）检测RNA溶液的吸光度OD260/OD280=1.8~2.0表示优质（280、260nm下的吸光度分别代表了核酸、和蛋白值），并可以检测浓度;2）RNA的电泳图谱：检测28S和18S条带的完整性和他们的比值。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，RNA的质量是好的;3）保温试验（检测有无微量RNA酶残留）4)直接逆转为cDNA，进行管家基因（如b-actin）PCR，琼脂糖电泳后，如有相应的产物条带，则说明RNA可以使用5、RNA保存：-80℃冻存；或逆转为cDNA保存（更安全）4、DNA污染的检测与处理1）检测方法：

a:用没有逆转录的RNA产物进行PCR，有产物生成，提示污染

b:设计上下游引物，使其与DNA互补位点之间包含内含子，来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短2）处理：在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理第10页,共45页，2024年2月25日，星期天五、逆转录反应

目的：以RNA为模板，逆转录合成cDNA措施：1.获取优质的RNA;2.采用优质的逆转录酶

AMV(禽成髓细胞瘤病毒)：逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃。

MMLV(Moloney鼠白血病病毒)：逆转录酶活性强，RNA酶H活性较弱。最适37℃或42℃。

3.引物选择:随机引物:适用于长的或具有发卡结构的RNA,特异性最低;。

Oligo(dT)：适用于具有PolyA尾巴的RNA

特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况

4、质量检测：进行管家基因（如b-actin）PCR5、产物保存：-20℃第11页,共45页，2024年2月25日，星期天First-StrandSynthesisofcDNA举例1.试剂(1)M-MLVReverseTranscriptase(200u/ul)（promega，Catalog#M1701)(2)M-MLV5×ReactionBuffer(3)rRNasin(40u/ul)（promega）(4)dNTP(10mMeach)（生工）(5)RandomPrimers（生工）(6)Nuclease-FreeWater2.操作步骤（1)TotalRNA2ugPrimer(0.5ug/ul)2ulNote:0.5ug/ugmRNANuclease-FreeWater11ulAddto15ul70℃，5分钟以溶解模板的二级结构，取出立即置冰上冷却（防止二级结构重新形成），简单离心。第12页,共45页，2024年2月25日，星期天M-MLV5×ReactionBuffer5uldNTP(10mMeach)1.25ulrRNasin(40u/ul)0.6ul=25uM-MLVReverseTranscriptase(200u/ul)1ulNuclease-FreeWater2.15ulTotalVolume25ul轻弹PCR管，使其混匀，简单离心。（3）在PCR仪上执行37℃60min（RandomPrimers，其它引物如Oligo(dT)用42℃）。（4）70℃10分钟后进行PCR或－20℃保存备用。（2）在冰上依次加入下列试剂：第13页,共45页，2024年2月25日，星期天六、聚合酶链反应（PCR)

目的：以cDNA为模板大量扩增目的基因片段措施：1.合适的PCR引物;2.合适的Taq酶；3.PCR条件的优化第14页,共45页，2024年2月25日，星期天PCR引物设计原理第15页,共45页，2024年2月25日，星期天PCR引物选择与设计引物选择与设计1.引用文献（影响因子较高的杂志或使用频率较高）;2.找引物合成公司设计；3.自己设计:目的不同引物要求也不同：1.用于分子克隆的引物：应涵盖目的基因全长，引入酶切位点；2.用于定性或半定量的PCR引物：涵盖部分目的基因即可（>200bp)；3.用于real-timePCR的引物：涵盖的目的基因不宜太长（150-250bp)第16页,共45页，2024年2月25日，星期天

用PrimerPremier5.0进行引物设计举例

以大鼠olig2的引物设计为例1、查找大鼠olig1mRNA碱基序列第17页,共45页，2024年2月25日，星期天第18页,共45页，2024年2月25日，星期天2、用PrimerPremier5.0进行引物设计

第19页,共45页，2024年2月25日，星期天第20页,共45页，2024年2月25日，星期天第21页,共45页，2024年2月25日，星期天第22页,共45页，2024年2月25日，星期天第23页,共45页，2024年2月25日，星期天第24页,共45页，2024年2月25日，星期天四种重要指标：发夹结构(Hairpin)、二聚体(Dimer)、错误引发情况(FalsePriming)、上下游引物之间二聚体形成情况(CrossDimer)第25页,共45页，2024年2月25日，星期天第26页,共45页，2024年2月25日，星期天第27页,共45页，2024年2月25日，星期天第28页,共45页，2024年2月25日，星期天Sense:5'ACCTCCGACGCCAAGTGA3‘Anti-sense:5'CGGTTCCCAAATAATACGC3'4、引物同源性分析（用Blast进行同源性比较）

检查引物的特异性3、PrimerPremier5.0设计的大鼠olig2引物第29页,共45页，2024年2月25日，星期天第30页,共45页，2024年2月25日，星期天第31页,共45页，2024年2月25日，星期天第32页,共45页，2024年2月25日，星期天第33页,共45页，2024年2月25日，星期天第34页,共45页，2024年2月25日，星期天第35页,共45页，2024年2月25日，星期天5、Blast进行同源性比较，确认引物的特异性后，联系公司，合成引物6、引物的溶解和稀释上下游引物干粉各加适量消毒双蒸水(灭菌注射用水)稀释至20μM,-20℃保存.第36页,共45页，2024年2月25日，星期天PCR举例第37页,共45页，2024年2月25日，星期天注意：此PCR反应条件中缺预变性（94℃，5min)和最后的产物延伸（72℃，10min)第38页,共45页，2024年2月25日，星期天第39页,共45页，2024年2月25日，星期天DNA琼脂糖凝胶电泳

准备试剂：1．电泳缓冲液：(TBE或TAE均可）(1)5×TBE:Tris54gBoricAcid27.5g0.5mol／LEDTA200mLpH=8.0定容至1000ml。(2)50xTAE

Tris

242g

冰醋酸

57mL

0.5mol／LEDTA200mL

pH8.0

定容至1000ml。

2．凝胶加样缓冲液(6×)

3．琼脂糖

4．溴化乙锭溶液(EB)10mg／mL

5．DNA分子量Marker

第40页,共45页，2024年2月25日，星期天实验步骤⑴配胶（1﹪琼脂糖凝胶）0.3g琼脂糖加入30ml0.5×TBE中，摇匀；在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解；冷却到60℃，加入3μl的EB，并摇匀.⑵制胶：把梳子插入制胶槽相应位置，将融解的琼脂糖倒入，室温冷却凝固，垂直向上拔出梳子，将凝胶连同胶槽置入电泳槽中，加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。(3)点样：用移液抢吸取PCR产物5μl于塑料纸上，再加入1μl的6×加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。(4)电泳：（由负极向正极电泳）打开电源开关，调节至合适电压(一般电场强度不要超过5V／cm)；可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约15min-30min。(5)观察：关掉电源，将凝胶小心的从电泳槽中取出，置于紫外透射检测仪上观察，拍照，并分析。第41页,共45页，2024年2月25日，星期天PCR反