酶的非水相催化

酶的非水相催化酶的非水相催化主要包括以下几种

一、有机介质中的酶催化二、气象介质中的酶催化三、超临界流体介质中的酶催化四、离子液介质中的酶催化

第2页,共48页，2024年2月25日，星期天一、有机介质中的酶催化

有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于底物、产物或者其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以具有催化功能。酶在有机介质中起催化作用时，酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键选择性和热稳定性等都有所改变。第3页,共48页，2024年2月25日，星期天二、气相介质中的酶催化

气相介质中的酶催化是指酶在气相介质中进行的催化反应。适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。由于气体介质的密度低，扩散容易，所以酶在气象介质中的酶催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。第4页,共48页，2024年2月25日，星期天三、超临界流体介质中的酶催化

超临界流体介质中的酶催化是指在超临界流体中进行的催化反应。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。对应用于酶催化反应的超临界流体的要求：应当对酶的结构没有破坏作用;对催化作用没有明显的不良影响；具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；超临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或在酶催化的最适温度附近；超临界压力不能太高，可节约压缩动力费用；超临界流体要容易获得，价格也要便宜。

第5页,共48页，2024年2月25日，星期天四、离子液介质中的酶催化

离子液介质中的酶催化是指酶在离子液中进行的催化作用。离子液是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在温室条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择型等显著特点。

第6页,共48页，2024年2月25日，星期天1984年，克里巴诺夫（klibanov）产物是:酯类、肽类、手性醇等有机化合物结论:酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应；也可以在水和有机溶剂组成的双液相体系中进行催化反应；还可以在只含有微量水的有机介质（microaqueousmedia,又称为微水介质）中进行催化反应。

第7页,共48页，2024年2月25日，星期天此后，人们对有机介质中酶的催化作用进行了许多研究，表明酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶，过氧化氢酶、过氧化物酶、醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、细胞色素氧化酶等氧化还原酶以及醛缩酶等转移酶中的十几种酶都可以在适当的有机溶剂介质中起催化作用。而且酶在有机介质中的热稳定性比水溶液中显著提高。

第8页,共48页，2024年2月25日，星期天第二节有机介质中水和有机溶剂对酶催化反应的影响

第9页,共48页，2024年2月25日，星期天有机介质反应体系包括:

（一）微水介质体系

（二）与水溶性有机溶剂组成的均一体系（三）与水不溶性有机溶剂组成的两项或多项体系（四）（正）胶束体系（五）反胶束体系

第10页,共48页，2024年2月25日，星期天（一）微水介质体系

微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。微量的水主要是酶分子的结合水,另外有一部分水分配在有机溶剂中。由于酶分子不能溶解于疏水有机溶剂，所以酶以冻干粉或固定化酶的形式悬浮于有机介质中，在悬浮状态下进行催化反应。通常所说的有机介质反应体系主要是指微水介质体系。

第11页,共48页，2024年2月25日，星期天（二）与水溶性有机溶剂组成的均一体系

这种均一体系是由水和极性较大的有机溶剂互相混合组成的反应体系。酶和反应底物都是以溶解状态存在均一体系中。能在该反应体系的进行催化反应的酶较少。然而该体系近几年来却受到人们的极大关注这是因为辣根过氧化物酶(HRP)可以在此均一体系中催化酚类或芳香胺类低物聚合生成聚酚或聚胺类物质。这些聚酚，聚胺类物质在环保黏合剂，导电聚合物和发光聚合物等功能材料的研究开发方面的应用引起了人们极大的兴趣。第12页,共48页，2024年2月25日，星期天（三）与水不溶性有机溶剂组成的两项或多项体系

这种体系是由水和疏水性较强的有机溶剂组成的两项或多相反应体系。游离酶亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机溶剂相。如果采用固定化酶，则以悬浮形式存在两相的界面。催化反应通常在两相的界面进行。一般适用于底物和产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催化反应。

第13页,共48页，2024年2月25日，星期天（四）（正）胶束体系

胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量的水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液滴内部。反应时酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物和产物在胶束内部，反应在胶束的两相界面中进行。

第14页,共48页，2024年2月25日，星期天（五）反胶束体系

反胶束又称为反胶体团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。表面活性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。反应时酶分子在反胶束内部的水溶液，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两相的界面中进行。在反胶束体系中，由于酶分子处于反胶束内部的水溶液中，稳定性好。反胶束与生物膜有相似之处，适用于生物膜表面或与膜结合的酶的结构，催化特性和动力学性质的研究。

第15页,共48页，2024年2月25日，星期天二、水对有机介质中酶催化的影响

（一）水对酶分子空间构象的影响

（二）水对酶催化反应速率的影响

（三）水活度

第16页,共48页，2024年2月25日，星期天（一）水对酶分子空间构象的影响

酶分子需要一层水化层；维持酶分子的完整的空间构象所必需最低水量称为必需水；必需水与酶分子的结构和性质有密切关系。不同的酶，所需求的必需水的量差别很大。例如，每分子凝乳蛋白酶只需50分子水，就可以维持其空间构象而进行正常的催化反应；而每分子氧化酶却需3500个水分子，才能显示其催化活性。

必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等键所必需的，而氢键和盐键又是酶空间结构的主要稳定结构的重要因素。第17页,共48页，2024年2月25日，星期天（二）水对酶催化反应速率的影响

有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。例如，马肝醇脱氢酶在水含量较低的情况下，酶的催化反应速度随水含量的增加而升高。在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。由于加进有机介质反应体系中的水，可以分布在酶分子、有机溶剂、固定化酶的载体或修饰酶的修饰剂等之中。因此，即使采用相同的酶，反应体系的最适水含量也会随着有机溶剂的种类、固定化载体特性、修饰剂的种类等的变化而有差别。在实际应用时应当根据实际情况，通过实验确定最适水含量。

第18页,共48页，2024年2月25日，星期天（三）水活度

一类是结合水，另一类是游离水。

在有机介质体系中，结合水是影响酶催化活性的关键因素。水活度是指体系中水的逸度与纯水逸度之比，通常可以用体系中水的蒸汽压与同条件下纯水蒸气压之比表示，如式:aw=rwXwXw——水的摩尔比；

rw——活度系数。第19页,共48页，2024年2月25日，星期天研究表明，在一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加。而最佳水活度与溶剂的极性大小无关。所以采用水活度作为参数来研究有机介质中水对酶催化作用的影响更为确切。不同的酶有不同的最佳水活度，在实际应用时要根据具体情况，通过实验得出最佳水活度。

第20页,共48页，2024年2月25日，星期天三、有机溶剂对有机介质中酶催化的影响

有机溶剂是有机介质反应体系中的主要成分之一。常用有机溶剂有辛烷、正己烷、苯、季丁醇、丙醇、巳酯、二氯甲烷等。在有机介质酶催化反应中，有机溶剂对酶的活力、酶的稳定性、酶的催化特性及酶催化速度等都有显著影响。

第21页,共48页，2024年2月25日，星期天（一）有机溶剂对酶结构与功能的影响

有些酶在有机溶剂作用下，其空间结构会受到某些破坏，从而使酶的催化活性受到影响甚至变性失活。例如，碱性磷酸酶冻干粉悬浮于乙腈中，22h,60％以上的酶不可逆的变性失活；悬浮于丙酮中36h，75％以上的酶呈现不可逆的失活等。酶分子在冷冻干燥的过程中，酶的活性中心构象会受到破坏，所以应当加进蔗糖、甘露醇等冷冻干燥保护剂。有些酶，如脂肪酶、蛋白酶、多酚氧化酶等，在有机溶剂中其整体结构和活性中心基本上保持完整，能在适当的有机介质中进行催化反应，然而也可能对酶的表面结构和活性中心产生影响。

第22页,共48页，2024年2月25日，星期天1、有机溶剂对酶分子表面结构的影响

酶在有机介质中与有机溶剂接触，酶分子的表面结构将有所变化。例如，枯草杆菌蛋白酶晶体，原来有119个与酶分子结合的水分子，悬浮在乙腈中后，与酶分子结合的水分子只有99个，有12个乙腈分子结合到酶分子中，其中有4个是原来的水分子结合位点。

第23页,共48页，2024年2月25日，星期天2、有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响

当酶悬浮于有机溶剂中，有一部分有机溶剂能渗入到酶分子的活性中心，与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物结合能力，从而影响酶的催化活性。例如，辣根过氧化物酶在甲醇中催化时，甲醇分子可以进入酶的活性中心，与卟啉铁配位结合；枯草杆菌蛋白酶悬浮在乙腈中，有4个乙腈分子进入酶的活性中心。此外，有机溶剂分子可以进入酶的活性中心，会降低活性中心的极性，可能降低酶与底物的结合能力。

第24页,共48页，2024年2月25日，星期天（二）有机溶剂对酶的活性影响

有机溶剂会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性。有机溶剂极性的强弱可以用极性系数lgP表示。P是指溶剂在正辛烷与水两相中的分配系数。极性系数越大，表明极性越小；反之极性系数越小，则极性越强。研究表明，有机溶剂的极性越强，越容易夺取酶分子的结合水，对酶活力的影响越大。例如，正己烷能够夺取酶分子0.5％的结合水，甲醇可以夺取酶分子结合水的60％。极性系数lgP＜2的极性溶剂一般不适于作为有机介质酶催化的溶剂使用。第25页,共48页，2024年2月25日，星期天（三）有机溶剂对底物和产物分配的影响

酶作用底物和反应后生成的产物—必需水层；有机溶剂能改变酶分子必需水层中底物和产物的浓度。所以应该选择极性适中的有机溶剂作为介质使用。一般选用2≤lgP≤5的有机溶剂作为有机介质为宜。有机溶剂对不同的酶和不同的反应有不同的影响。因此，作为催化介质使用的有机溶剂必须通过实验进行选择、确定。第26页,共48页，2024年2月25日，星期天第三节

酶在有机介质中的催化特性

第27页,共48页，2024年2月25日，星期天一、非水介质中酶的结构

酶在含微量水的有机溶剂中以悬浮状态起催化作用。第28页,共48页，2024年2月25日，星期天实验证实了在有机相中酶能够保持其整体结构的完整性，有机溶剂中酶的结构至少是酶活性部位的结构与水溶液中的结构是相同。第29页,共48页，2024年2月25日，星期天1、酶在有机溶剂中维持天然构象的原因酶分子结构的动态变化很可能是主要因素。酶蛋白的三级结构（“柔性”

）。这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”而又有“开启”的状态。“紧密”

-----分子内的氢键；“开启”

-----溶液中水分子与蛋白质分子之间所形成的氢键使分子内氢键受到一定程度的破坏，酶蛋白结构变得松散，呈一种“开启”状态。酶分子的“紧密”和“开启”两种状态处于一种动态的平衡中，表现出一定的“柔性”。第30页,共48页，2024年2月25日，星期天2、测定非水介质中酶结构的方法

FT—IR是一种测定非结晶固体酶分子二级结构的理想方法。双亲分子增溶法此种增溶方法不同于反相胶束，酶分子所处的微环境最接近于固体酶分子悬浮于有机溶剂中的情形，酶分子在有机溶剂中是均相的，能够对这种酶—表面活性剂复合物进行光谱分析。

第31页,共48页，2024年2月25日，星期天3、反相胶束中酶活性的保持

在反相胶束中研究得比较多的是水溶性蛋白酶，包括单体酶和多聚体酶。一些膜蛋白，(如细胞色素氧化酶，肌浆网状体Ca-ATP酶、亚线粒体ATP酶)，附着于生物膜表面或介于两膜表面之间的蛋白质(如细胞色素C、髓磷脂碱性蛋白)也在反相胶束中进行了研究。这三种类型的酶在反相胶束中是如何排列的?可用几种模型来表示。

第32页,共48页，2024年2月25日，星期天*几种模型(a)可溶性酶

(b)生物膜表面的酶

(c)膜整合蛋白

第33页,共48页，2024年2月25日，星期天二、非水介质中的酶学性质

（一）热力学稳定性

（二）底物特异性

（三）对映体的选择性

（四）位置选择性

（五）化学键选择性

（六）“pH记忆”与“pH忘记”

第34页,共48页，2024年2月25日，星期天（一）热力学稳定性

有机溶剂中酶的热稳定性和贮存稳定性都比水溶液中高。猪胰脂肪酶(PPL)在苯中催化酯交换反应时，酶活性随温度升高(20—70℃)而增加，而且在70℃连续反应7次(每次96h)后酶活性仍保持60％；PPL在有机溶剂中100℃时的半衰期可达数十小时，而在水中100℃几乎马上失活；PPL的稳定性取决于有机溶剂中水的浓度，1％的水浓度会使PPL的稳定性降低到和水溶液中相同的水平。胰凝乳蛋白酶在无水辛烷中20℃放置6个月后酶活力没有降低，而在同样温度下酶在水溶液中的半衰期仅有几天。

第35页,共48页，2024年2月25日，星期天（二）底物特异性

酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。在正己烷中催化2—辛醇与不同链长的脂肪酸进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸具有较强的特异性。介质改变时，酶的底物专一性和催化效率会发生改变。另一方面，底物在反应介质与酶活性中心之间分配的变化也是影响酶的底物专一性及其催化效率的因素之一，而底物和介质的疏水性直接影响底物在两者之间的分配。如木瓜蛋白酶催化N—苄氧羰基—甘氨酸(N—Cb2—甘氨酸)与甲醇的甲酯化反应中，随着溶剂疏水性的减小，底物倾向于分配在溶剂中而不是疏水的活性中心。第36页,共48页，2024年2月25日，星期天（三）对映体的选择性

酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力，这种选择性是由两种对映体的非对映异构体的自由能差别造成的。有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲(疏)水性的变化而发生改变，例如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶等蛋白水解酶对于底物N—Ac-A1a—OetCl(N—乙酰基丙氨酸氯乙酯)的立体选择因子[即(kcaL／Km)l／(kcat／Km)D的比值]在有机溶剂中为10以下，而在水中为103一104数量级。

第37页,共48页，2024年2月25日，星期天（四）位置选择性

有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性(regioselectivity)，即酶能够选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应。Klibanov用猪胰脂肪酶在无水吡啶中催化各种脂肪酸(C2脂肪酸，C4脂肪酸，C8脂肪酸，C12脂肪酸)的三氯乙酯与单糖的酯交换反应，实现了葡萄糖1位羟基的选择性酰化。当然不同来源的脂肪酶催化上述反应时，选择性酰化羟基的位置不同。

第38页,共48页，2024年2月25日，星期天（五）化学键选择性

化学键的选择性也是非水介质中酶催化的一个显著特点。As—pergillusninger脂肪酶催化6—氨基—1—己醇的酰化反应时，羟基的酰化占绝对优势，这种选择性与传统的化学催化完全相反。这样就可以在不需基团保护的情况下合成氨基醇的酯。

第39页,共48页，2024年2月25日，星期天（六）“pH记忆”与“pH忘记”

有机溶剂中的酶能够“记忆”在冻干或丙酮沉淀前所在缓冲液中的pH状态。称这种现象为“pH记忆”。利用酶的“pH记忆”可以控制有机相中酶催化的最适pH。在微水有机溶剂中疏水性的酸或碱与它们相应的盐所组成的混合物，可以作为有机相缓冲液，它们以中性和离子对形式能够充分溶于有机相，而不能进入水或其它极性溶液，这两种存在形式的比例控制着有机相中酶的解离状态，使酶完全“忘记”干燥前它所处的水溶液的pH，即干燥前缓冲液的pH值对微水有机溶剂中的酶活性几乎没有什么影响。

第40页,共48页，2024年2月25日，星期天第四节

有机介质中酶催化反应的条件及控制

第41页,共48页，2024年2月25日，星期天一、有机介质中酶催化反应的类型

1.

合成反应2.

转移反应3.

醇解反应4.

氨解反应5.

异构反应6.

氧化还原反应7.裂合反应

第42页,共48页，2024年2月25日，星期天二、酶的选择

要进行酶在有机介质中的催化反应，首先选择好所用的酶。在酶催化反应时通常酶所作的底物浓度远远高于酶的浓度，所以酶催化反应速度随着酶浓度的升高而升高，两者呈正比。在有机介质中，进行催化反应，对酶的选择不但看催化速度的大小，还要特别注意酶的稳定性、底物专一性、对应体选择性、区域选择性、键选择性等。

第43页,共48页，2024年2月25日，星期天三、底物的选择和浓度控制

底物的浓度对酶催化反应速度有显著影响，一般来说，在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速率随底物浓度的升高而怎加。当底物达到一定浓度后，再增加底物浓度，反应速度的增大幅度逐渐减小，最后趋于平衡，逐步接近最大反应速度。酶在有机介质中进行催化，要考虑底物在有机溶剂和必需水层的分配情况。此外，有些底物在高浓度时，会对反应产生不利影响