透射电子显微镜技术

透射电子显微镜技术主要内容电子显微镜概述透射电子显微镜及相关技术第2页,共100页，2024年2月25日，星期天

电子显微镜概述电子显微镜发展史电子显微镜的基本类型电子显微镜的基本结构电子显微镜的医学应用第3页,共100页，2024年2月25日，星期天

电子显微镜概述电子显微镜：根据电子光学原理，用电子束和电磁透镜代替光束和光学透镜来照射样品，获得极高分辨率的显微镜，简称电镜。产生基础：

根据波动学说，运动着的电子可以看作是一种电子波。轴对称分布的电磁场具有能使电子束偏转、聚焦的作用。第4页,共100页，2024年2月25日，星期天

电子显微镜概述第5页,共100页，2024年2月25日，星期天电子束与物质的作用俄歇电子感应电导入射电子二次电子背散射电子吸收电子样品特征X射线荧光透射电子

电子显微镜概述第6页,共100页，2024年2月25日，星期天一、电子显微镜发展史1924，DeBroglie提出波粒二象性假说1926，Busch发现电子可由外加电磁场的改变而偏折1933，Knoll和Ruska发明第一台电子显微镜（50nm）1935，Knoll第一部扫描电子显微镜1938，Ruska第一部透射电子显微镜1939，西门子商用透射电子显微镜（10nm）1942，实验用扫描电子显微镜1958，中国研制成功透射式电子显微镜，其分辨本领为3nm1979，大型电子显微镜0.3nm

电子显微镜概述第7页,共100页，2024年2月25日，星期天ErnstRuskaGerdBinnigHeinrichRohrer因为发明EM和STM而分享1986年的诺贝尔物理学奖

电子显微镜概述第8页,共100页，2024年2月25日，星期天二、电子显微镜基本类型

电子显微镜概述

透射电镜

(Transmissionelectronmicroscope,TEM)

观察细胞内部结构

扫描电镜（Scanningelectronmicroscope,SEM)

观察组织或细胞表面的立体形貌第9页,共100页，2024年2月25日，星期天

电子显微镜概述第10页,共100页，2024年2月25日，星期天俄歇电子感应电导入射电子二次电子背散射电子吸收电子样品特征X射线荧光透射电子能谱仪（EDS）波谱仪（WDS）电子探针（EPMA)TEMSEM

电子显微镜概述电子束与物质的作用第11页,共100页，2024年2月25日，星期天我室现有两台电子显微镜

电子显微镜概述SEMHITACHIS-3000NTEMHITACHIH-7500第12页,共100页，2024年2月25日，星期天三、电子显微镜的基本结构电子光学系统真空系统电源系统操作控制系统观察系统

电子显微镜概述第13页,共100页，2024年2月25日，星期天电子光学系统电子枪——

发射自由电子形成电子束电磁透镜——

用一个对称于镜筒轴线的空间电场或磁场使电子轨迹向轴线弯曲聚焦形成电子束

电子显微镜概述第14页,共100页，2024年2月25日，星期天四、电子显微镜的医学应用细胞学和分子生物学中的应用解剖学中的应用病毒研究方面的应用临床超微病理诊断中的应用

电子显微镜概述第15页,共100页，2024年2月25日，星期天细胞学和分子生物学中的应用

电子显微镜概述细胞亚显微结构模式图

组织细胞内亚显微结构第16页,共100页，2024年2月25日，星期天骨骼肌肌丝纵断面SEM×30000TTMiNZSR

电子显微镜概述第17页,共100页，2024年2月25日，星期天骨骼肌肌丝纵断面TEM×29000

*Z**SRTT

第18页,共100页，2024年2月25日，星期天骨骼肌肌丝横断面

TEM×40000

电子显微镜概述第19页,共100页，2024年2月25日，星期天解剖学中的应用

电子显微镜概述肛门内括约肌

内耳毛细胞

第20页,共100页，2024年2月25日，星期天病毒研究方面的应用H1N1流感病毒

电子显微镜概述第21页,共100页，2024年2月25日，星期天H1N1流感病毒

电子显微镜概述第22页,共100页，2024年2月25日，星期天临床超微病理诊断中的应用—肾活检

电子显微镜概述足突融合系膜基质增生第23页,共100页，2024年2月25日，星期天肌营养不良肌肉糖原贮积病临床超微病理诊断中的应用—肌活检

电子显微镜概述第24页,共100页，2024年2月25日，星期天婴儿肝炎综合症临床超微病理诊断中的应用—肝活检

电子显微镜概述第25页,共100页，2024年2月25日，星期天临床超微病理诊断中的应用—神经活检轴索变性节段性脱髓鞘

电子显微镜概述第26页,共100页，2024年2月25日，星期天临床超微病理诊断中的应用—皮肤活检

电子显微镜概述角质层疏松变成纤细胞沉积致密颗粒第27页,共100页，2024年2月25日，星期天临床超微病理诊断中的应用

电子显微镜概述毛细胞性白血病第28页,共100页，2024年2月25日，星期天

透射电子显微镜及相关技术透射电镜基本结构透射电镜成像原理透射电镜主要性能指标透射电镜相关技术

——超薄切片技术

——负染色技术

——免疫电镜技术五.细胞超微结构简介第29页,共100页，2024年2月25日，星期天一.透射电镜基本结构电子光学系统观察记录显示系统真空系统电源系统操作控制系统第30页,共100页，2024年2月25日，星期天电子照明系统成像系统观察记录显示系统电子光学系统一.透射电镜基本结构第31页,共100页，2024年2月25日，星期天阴极控制极阳极电子束聚光镜样品1.电子照明系统—

电子枪，聚光镜一.透射电镜基本结构电子枪第32页,共100页，2024年2月25日，星期天电子枪

——

电子束的发射源。常用的是发夹形热钨丝三电极式电子枪。灯丝（阴极）由钨丝制成，通电加热后发射电子发射出的电子束受处于负电位的栅极所调制,并被阳极的高电位（几十～几百千伏）区加速后形成一束“光源”,即电子源。另外还有六硼化镧阴极、点阴极和场发射电子枪等几种高亮度新型电子枪。一.透射电镜基本结构第33页,共100页，2024年2月25日，星期天聚光镜

——

一种电磁透镜，由外包铁壳的线圈形成。当线圈中通有电流时，铁壳的缝隙处集中产生磁场，控制电子束的运动。聚光镜的作用是将电子枪发出的电子流会聚后照射到样品上。

一.透射电镜基本结构第34页,共100页，2024年2月25日，星期天2.电子成像系统

——

样品及样品以下的电磁透镜样品

经特殊制备的超薄样品被放在直径3mm的载网上，再把载网放在支架上并插入透射电镜中。样品架可以平移、倾动和旋转。

一.透射电镜基本结构第35页,共100页，2024年2月25日，星期天样品以下的电磁透镜——

物镜、中间镜和投影镜改变各透镜电流可以在很大范围内改变图像的大小图像的聚焦是靠调节物镜电流来实现的物镜是整个仪器中最重要的部分，它决定电镜分辨率一.透射电镜基本结构第36页,共100页，2024年2月25日，星期天人眼无法观测电子，TEM中的电子信息通过荧光屏和照相底版转换为可观察图像。3.观察记录显示系统

上图为我室透射电镜安装的侧插式数码成像系统——SISMegaviewⅢ一.透射电镜基本结构第37页,共100页，2024年2月25日，星期天真空系统一.透射电镜基本结构由机械泵、油扩散泵、离子泵、真空测量仪表及真空管道组成。它的作用是排除镜筒内气体，保持一定的镜筒真空度。如果真空度低的话，电子与气体分子之间的碰撞引起散射而影响衬度，还会使电子栅极与阳极间高压电离导致极间放电，残余的气体还会腐蚀灯丝，污染样品。第38页,共100页，2024年2月25日，星期天电源系统一.透射电镜基本结构第39页,共100页，2024年2月25日，星期天操作控制系统一.透射电镜基本结构第40页,共100页，2024年2月25日，星期天ImageSampleObjectiveLens(IlluminationSource)LumpOMCondenserLensProjectionLensScreenImageImageSampleSampleObjectiveLensElectronSourceCondenserLensDeflectionCoilsSEDetectorCRTTEMSEMFluorescentscreenScanningTheoryofTransmissionElectronMicroscopeDifferenceamongOM,TEMandSEM第41页,共100页，2024年2月25日，星期天二.透射电镜成像原理

光学显微镜中图像的衬度（即对比度或反差）决定于样品上各部位对光的不同吸收。电镜中图像衬度的形成却主要靠样品对电子波的散射及其相互间的干涉。通常可以把图像衬度分成散射吸收衬度，衍射衬度和相位衬度。

第42页,共100页，2024年2月25日，星期天二.透射电镜成像原理在真空条件下，电子束经高压加速后，穿透样品时形成散射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。电子枪和电磁透镜对电子束的作用决定电镜成像质量。第43页,共100页，2024年2月25日，星期天吸收像：当电子射到质量、密度大的样品时，主要的成像作用是散射作用。样品上致密和较厚的部分对电子的散射角大，被物镜下方设置一个带孔的圆片（即物镜光阑）拦掉，这样通过的电子较少，像的亮度较暗，反之则为亮区。这种衬度称散射吸收衬度，可以提供样品形态方面的信息。早期的透射电子显微镜都是基于这种原理。

二.透射电镜成像原理第44页,共100页，2024年2月25日，星期天衍射像：电子束被样品衍射后，样品不同位置的衍射波振幅分布对应于样品中晶体各部分不同的衍射能力，当出现晶体缺陷时，缺陷部分的衍射能力与完整区域不同，从而使衍射波的振幅分布不均匀，反映出晶体缺陷的分布。相位像：当极薄、小颗粒或低密度样品成像时，主要应该利用相位衬度。样品受电子波照射后会产生不同的散射波。在条件合适时，这些散射波将按一定的相位关系干涉成像，这就是相位衬度像。它是一种高分辨率的像，可用于研究原子尺度（小于10埃）的样品微结构。二.透射电镜成像原理第45页,共100页，2024年2月25日，星期天一般生物医学常用透射电镜分辨率0.1～0.3nm放大率50～500000电压在20～200KV样品厚度<100nm三.主要性能指标第46页,共100页，2024年2月25日，星期天是TEM的最主要性能指标，表征电镜显示亚显微组织、结构细节的能力。点分辨率：能分辨两点之间的最短距离线分辨率：能分辨两条线之间的最短距离，通过拍摄已知晶体的晶格象测定，又称晶格分辨率。三.主要性能指标分辨率第47页,共100页，2024年2月25日，星期天指电子图像对于所观察试样区的线性放大率。目前高性能TEM的M范围为80～100万倍。不仅考虑最高和最低放大倍数，还要考虑是否覆盖低倍到高倍的整个范围。电镜不能将其所分辨的细节放大到人眼可辨认程度。对细节观察是用电镜放大在荧光屏上成像，经附带的立体显微镜进行聚焦和观察。将仪器的最小可分辨距离放大到人眼可分辨距离所需的放大倍数称为有效放大倍数。一般仪器的最大倍数稍大于有效放大倍数。放大倍数—常数—中间镜激磁电流三.主要性能指标第48页,共100页，2024年2月25日，星期天人眼分辨本领约0.2mm，光学显微镜约0.2μm。把0.2μm放大到0.2mm的放大倍数是1000倍,是有效放大倍数。光学显微镜分辨率在0.2μm时，有效放大倍数是1000倍。光学显微镜的放大倍数可以做的更高，但高出部分对提高分辨率没有贡献，仅是让人眼观察舒服。关于放大倍数的几点说明：三.主要性能指标第49页,共100页，2024年2月25日，星期天指电子枪阳极相对于阴极灯丝的电压，决定了发射的电子的λ和E。电压越高，电子束对样品的穿透能力越强（厚样品）、分辨率越高、对样品的辐射损伤越小。普通TEM的最高V一般为100kV和200kV，通常所说的V是指可达到的最高加速电压。加速电压三.主要性能指标第50页,共100页，2024年2月25日，星期天四.透射电镜相关技术透射电镜生物样品制备要求超薄切片技术负染色技术免疫电镜技术第51页,共100页，2024年2月25日，星期天1.透射电镜生物样品制备要求四.透射电镜相关技术电镜标本观察条件：高真空、高电压、能够散射电子生物样品特点：含有大量水分、电子密度低（主要是C、H、O）生物样品制备目的：去除水分，增加标本中能够散射电子的重原子第52页,共100页，2024年2月25日，星期天四.透射电镜相关技术新刀锋产生于断端超薄切片刀：玻璃刀、钻石刀玻璃制刀机2.超薄切片技术第53页,共100页，2024年2月25日，星期天2.超薄切片技术四.透射电镜相关技术超薄切片机原理示意图超薄切片机第54页,共100页，2024年2月25日，星期天超薄切片技术——玻璃刀切片四.透射电镜相关技术第55页,共100页，2024年2月25日，星期天Thinsections四.透射电镜相关技术第56页,共100页，2024年2月25日，星期天载网分类及选择：

1.分类：铜网、镍网、金网，根据用途不同分别采用，如酶细胞化学、免疫金标记技术等需采用后两者；

2.支持膜：贴附于载网，用来观察悬浮的病毒、脂质体及其它颗粒物质的均质性膜，包括Formvar膜、碳膜等。四.透射电镜相关技术第57页,共100页，2024年2月25日，星期天SpecimenPreparationforElectronMicroscopyThinSectioningforTEMThewaxsections:3-10um;ThePlasticultrathin-sectionsforTEM:40-50nmSectionsofLM:>5um;SectionsofTEM:<100nm

四.透射电镜相关技术第58页,共100页，2024年2月25日，星期天第59页,共100页，2024年2月25日，星期天四.透射电镜相关技术超薄切片技术

—生物样品制备流程取材——漂洗（缓冲液）——前固定（2.5%戊二醛）——漂洗（缓冲液）——后固定(1%锇酸)——漂洗（缓冲液）——梯度脱水——浸透（树脂）——包埋——聚合——超薄切片——电子染色——TEM

观察/search/BBSArchive_285474_1.htm第60页,共100页，2024年2月25日，星期天定义：染液中的高电子密度物质包围低电子密度的样品，染色结果使背景是黑暗的，而样品部分呈“透明”的光亮区，故称之为负染色。用途：用于观察生物大分子、病毒、细菌、分离的细胞器以及蛋白质晶体等颗粒性物质的结构、大小以及形状等。3.负染色技术四.透射电镜相关技术第61页,共100页，2024年2月25日，星期天负染色方法液滴20µL样品悬液双蒸水负染液负染液Parafilmgrid四.透射电镜相关技术第62页,共100页，2024年2月25日，星期天负染色技术的应用四.透射电镜相关技术第63页,共100页，2024年2月25日，星期天负染色技术的应用四.透射电镜相关技术来自于加州一位患者的H1N1流感患者样本的病毒透射电镜照片，4月28日from美国疾控中心（CDC)经过处理后，病毒的超微结构更将明显地显露出来。第64页,共100页，2024年2月25日，星期天负染色技术的应用四.透射电镜相关技术CDC发表的1976年流行的猪流感病毒照片

1918流感病毒即为西班牙流感病毒第65页,共100页，2024年2月25日，星期天4.免疫电镜技术免疫电镜技术

是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学主要使用的示踪物：重金属（如胶体金）酶（如HRP）四.透射电镜相关技术第66页,共100页，2024年2月25日，星期天免疫电镜技术类型主要分为两大类：免疫凝集电镜技术：即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察免疫电镜定位技术：利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由标示物指示出相应抗原所在的部位四.透射电镜相关技术第67页,共100页，2024年2月25日，星期天免疫凝集免疫电镜定位第68页,共100页，2024年2月25日，星期天五.细胞超微结构简介细胞膜及特化结构细胞核细胞器第69页,共100页，2024年2月25日，星期天

人胚胎成纤维细胞核大，胞质较少，有较发达的粗面内质网（▲）及线粒体，在细胞及细胞突起表面均可见质膜（↑）包绕。

×18000

细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第70页,共100页，2024年2月25日，星期天人肠吸收上皮细胞，细胞表面有微绒毛（↑），绒毛中心有微丝束组成的轴心，深入胞质浅面。绒毛表面可见呈丝网状的细胞外衣（▲）。

×16000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第71页,共100页，2024年2月25日，星期天兔输卵管纤毛柱状上皮细胞，细胞表面可见纤毛纵剖面（↑），内有微管，纤毛下端有基体（▲）×15000，角图纤毛横剖面，可见9+2微管结构。×16000

细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第72页,共100页，2024年2月25日，星期天细胞膜及特化结构人胚胎肠上皮细胞横剖面，核大，胞质少，环绕细胞四周有质膜（↑），细胞间有原始连接（▲）。

×20000

五.细胞超微结构简介第73页,共100页，2024年2月25日，星期天细胞膜及特化结构人胃粘液腺细胞间腺腔，表面有微绒毛（↑），有纵切及横切面，细胞间有紧密连接（▲）×20000五.细胞超微结构简介第74页,共100页，2024年2月25日，星期天人鳞状上皮棘细胞，细胞突起间可见桥粒（↑）。×31000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第75页,共100页，2024年2月25日，星期天人肠吸收上皮细胞，细胞间可见桥粒（↑）

×30000

角图桥粒放大×70000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第76页,共100页，2024年2月25日，星期天人鳞状上皮细胞，基底面可见半桥粒（↑），相邻有基板（▲）。

×18000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第77页,共100页，2024年2月25日，星期天

相邻血管内皮细胞间可见紧密连接（↑），胞质内有波形蛋白中丝（▲）。×10000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第78页,共100页，2024年2月25日，星期天人鼻咽部纤毛上皮细胞间紧密连接（黑“↑”）。×21000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第79页,共100页，2024年2月25日，星期天人肠吸收上皮细胞间可见复合连接（黑“↑”），胞质内有多聚核糖体（黑“▲”）。×45000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第80页,共100页，2024年2月25日，星期天

人胃粘膜上皮基底细胞，基底面质膜外可见基板（黑“↑”）。×12000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第81页,共100页，2024年2月25日，星期天人肌内毛细血管内皮细胞，胞质内可见大量圆形胞饮小泡（↑）及少数Weibel-Palad小体（▲）。×16000细胞膜及特化结构五.细胞超微结构简介第82页,共100页，2024年2月25日，星期天细胞核核膜染色质核仁人胃粘液上皮细胞，可见由核外膜（↑）、核内膜（白↑）、核周隙及核孔（▲）组成的核膜，核内有常染色质及异染色质。

×13000五.细胞超微结构简介第83页,共100页，2024年2月25日，星期天人鼻咽部上皮细胞，可见部分细胞核，核内外膜、核周隙及核孔均清楚可见，核邻近可见核孔横剖面（↑）。×32000

细胞核核膜染色质核仁五.细胞超微结构简介第84页,共100页，2024年2月25日，星期天人鼻咽部上皮细胞核内可见多个聚集的染色质间颗粒（↑），及核模邻近单个的染色质周颗粒（▲）。

×32000细胞核核膜染色质核仁五.细胞超微结构简介第85页,共100页，2024年2月25日，星期天

人鼻咽部上皮细胞核内可见核仁，由深色的核仁丝（白“↑”）及浅色的基质（白“▲”）组成。×18000

细胞核核膜染色质核仁五.细胞超微结构简介第86页,共100页，2024年2月25日，星期天大白鼠肝细胞核内核仁，可见核仁丝由颗粒状（白“↑”）及原纤维状（黑“↑”）结构组成。×12000细胞核核膜染色质核仁五.细胞超微结构简介第87页,共100页，2024年2月25日，星期天细胞内各细胞器

大鼠肝细胞胞质内可见线粒体（↑），游离多聚核糖体（▲）及粗面内质网膜旁核糖体。×45000

五.细胞超微结构简介第88页,共100页，2024年2月25日，星期天大鼠肝细胞胞质，内有线粒体（↑）及高尔基体（▲），线粒体由外膜、内膜、外腔、内腔、嵴、基质及基质颗粒组成。

×40000细胞内各细胞器五.细胞超微结构简介第89页,共100页，2024年2月25日，星期天人肾曲小管上皮细胞，基底端胞质内可见大量线粒体（白“↑”），基质电子密度高，质膜邻近有基板（黑“▲”）。

×32000细胞内各细胞器五.细胞超微结构简介细胞内各细胞器五.细胞超微结构简介第90页,共100页，2024年2月25日，星