CRISPRi在结核分枝杆菌生物学研究中的应用及优化

挑战。耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)菌株使得结核病结核病是全球性公共卫生问题。根据世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)报告，2022年，全球估算的结核病新发患者数为750万例[1]。lusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsinCRISPRi)是采用Cas9蛋白的核酸酶结构域突变体的新遗传工具。应用该技术原核生物具有类似真核生物的RNAi系统[2],但与真核生物相比，这些片段的适应性免疫系统。该系统广泛分布在90%的古菌和40%的细菌基因组中[3],与宿主细胞内生存能力有关[4]。此外，噬菌体也存在CRISPR系统[5]。根据Cas蛋白亚基的数量，目前CRISPR/Cas系统分成两类。第一类包括Cas蛋RISPR/Cas系统可以识别和切割外来核酸，在单链向导RNA(sin-strandbreak,DSB)。细菌可以通过非同源末端连接(non-homologous消除或破坏靶基因的功能[7,9],而HDR途径需要同源模板进行修复。在真核用于基因插入或单碱基编辑[10]。(二)CRISPRi技术tivatedCas9,dCas9)仍然可以与sgRNA结合的特性[11],使dCas9-sgRNA终止转录起始或延伸。胞苷脱氨酶(cytidinedeaminase,CDA;EC分别不可逆地催化胞苷(Cytidine,C)和脱氧胞C→G(Guanine,鸟嘌呤)或C→A(Adenine,腺嘌呤)的突变。CRISPR/dCas9主要通过易错修复造成点突变[12]。此外，转录因子靶向嵌合(TRAnscripti靶向降解DNA结合蛋白[13-14]。泛应用，包括神经细胞[15]、T细胞[16]、气道上皮细胞[17]、癌细胞[18-19]、干细胞[20-21]等。此外，CRISPRi技术目前也成功应用于酵母[22-23]、寄生虫[24]和病毒[25]研究。CRISPRi可以特异性地靶向基因组(一)基因功能分析和遗传筛选terferenceandactivation功能[26]。种高通量方法为研究原核和真核基因组编码的机制和相互作用提供了很有前途用CRISPRi研究生物合成途径、调控因子、细胞分裂等方面。Rousset等[27]在大肠埃希氏菌进行全基因组CRISPRi筛选是一个大规模基因-表型关联研究标基因[28]。通过构建CRISPRiESC(embryonicstemcells)和KI(knock-in)小鼠能在发育或疾病环境中研究特定基因功能和进行高通量筛选[29]。(二)治疗疾病(2)体外的靶基因沉默，其中CRISRPi应用于细胞，主要是干细胞，然后将其响的细胞类型[30-31],而治疗疾病途径是靶向驱动破坏疾病通路的基因，从而减缓疾病进程[32]。除了在体内抑制靶基因之外，CRISPRi同样可以抑制干用，尤其是CRISPRi技术，已扩展了iPSC的潜力。目前，该方法已经运用于神经系统疾病[33]、心脏病[34]、唐氏综合征[35]等疾病的研究。Hsu等[36]使用CRISPRi系统在脂肪来源干细胞(adipose-derivedstemcell,ASC)(三)代谢工程中的调控争途径的基因还提高了所需天然产物的含量[37]。竞争途径的下调使所需代谢物能够通过质粒中携带的合成途径或者通过宿主细胞基因组编码的天然代谢过代谢途径，如聚羟基丁酸酯(PHB)[38]、异戊二烯[39]、赤松素[40]、瓜氨酸[41]等合成途径。近年来，耐多药结核病(multidrug-resistant,MDR-TB)和广泛耐药结核病(extensively点的重要工具。在分枝杆菌中使用CRISPRi技目前，对分枝杆菌的基因功能研究主要集中在毒力和致病性上[45-47]。该技术在分枝杆菌中不仅能抑制单个靶标，而且能同时沉默多个开放阅读框(open [50-52]、sRNA调控[53]、DNA损伤因子[54]和抗酸性[55]的基因功能分析中发挥了巨大作用(表1)。CRISPRi技术可以对MTB的特定基因进行功能表1CRISPR技术研究分枝杆菌基因的功能白嘉诚等[牛宏红等]调控生长和渗透调节有关的基因Barman等必需基因大幅降低[56]。为了克服这一挑战，CRISPRi作为一种新型基因编辑工具，其重要作用在多项研究中得到印证。Rock等[57]利用CRISPRi技术成功地抑制(二)筛选抗生素新靶点和研究MTB的耐药机制3341)[58]、3-脱氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶(3-deoxy-d-arabino-heptulosonate7-phosphatesynthase,DAHPS)[-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphat有低水平的交叉耐药性[63]。通过CRISPRi技术发现异烟肼(isoniazid,I同杀菌作用。此外，CRISPRi还成功预测了新型候选药或RFP的协同作用[64]。此外，利用CRISPRi抑制修饰分枝杆菌细胞壁肽聚糖 (peptidoglycan,PG)的基因发现：抑制PG修饰可与β-内酰胺类药物协同治疗耐多药结核病感染[65]。早期发现和预测交叉耐药性或者药物的相互作用建一个更强大的结核病抗生素发现平台[66],最终有助于发现抗结核药物新靶(三)研究MTB与宿主的免疫应答病新疫苗仍然是控制结核病的关键因素之一[67]。虽然接种卡介苗(BacilleCalmette-Guerin,BCG)可以保护儿童免受结核病的传播感染，但它并不能防duri等[68]利用CRISPRi系统抑制突变菌株BCG的阿拉伯呋喃糖基转移酶C(arabinofuranosyltransferaseC,aftC)产生了短的免疫原性脂阿拉伯聚糖蛋白。该突变菌株感染THP-1细胞会产生更多免疫激活的表型[68]。这也揭的基因编辑技术，CRISPRi对目标基因的抑制效率可以高达99.9%[73]。此外CRISPRi还可以靶向非编码RNA(nonco也存在不足之处。原间隔序列(protospaceradjacentmotif,PAM)会限制潜在靶序列的数量[73]。靶基因的特异性序列(包括PAM和sgRNA序列)长度，子驱动的基因时[74]。效调节单个到多个必需基因[75]。因为CRISPRi系统中化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9的基因敲除效率较低且蛋白毒性较大，因此Rock等筛选出了4种不同的Cas9同源物，其中最有效的是来自嗜热链球菌(S.thermop因的功能，并且可以用于鉴定新的抗结核药物靶点[48]。CRISPRi系统中编码 [69,76]。然而sgRNA在pRH2521载体中的克隆效率较低。因此，Nadolinskaia等对pRH2521载体进行修改以优化克隆能力，改造后的pRH2502/pRH2521-aCRISPRi系统更好地抑制MTB腺苷酸环化酶相关基因的转录[77]。JR965/plJR962质粒中已将sgRNA和dCas9片段编码在同一个载体中[57],大B复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)成达差异。该研究也发现了MTBC成员之间对CRISPRi的沉默应答不同[78]。枝杆菌中高度保守的1153种蛋白质和843个CRISPRi质粒[79]。使用高通量病原体相互作用，鉴定宿主靶向治疗(host-directed潜在靶点，并改进结核病治疗方法[80]。此外，将遗传方法与化学筛选结合，干扰该技术的效率也应予以考虑[81]。作为细菌基因组工程中的工具，CRISP[1]WorldHealthOrganization.GlobalGeneva:WorldHealthO/publications/i/item/9789240083851.[2]TorriA,JaegerJ,PradeuT,etal.TheoriginofRe:adaptiveorneutralevolution?[J].PLoSBiol,2022,20(6):e300171[3]SorekR,KuninV,HugenholtzP.CRISPR--awidesp[J].NatRevMicrobiol,2008,6(3):181-186.DOI:10.1038/nrmicro179[4]HuangQ,LuoH,LiuM,etession,morphologyandmacrophagesurvivalofMycobacteriumsmegmatis[J].InfectGenetEvol,2016,4[5]Al-ShayebB,SkopintsevP,SoczekKM,etdedCRISPR-Cassystems学报，2021,61(2):300-314.DOI:10.13343/ki.wsxb.20200205.[7]ChenE,Lin-ShiaoE,TrinidadM,etal.DecoratSA,2022,119(49):e2204259119.DOI:10.1073/pnas.2204259119.[8]滕小龙，史硕博.CRISPR/Cas9系统在基因组编辑中的优化与发展成生物学，2022:1-19.DOI:10.12211/2096-8280.2022-047.[9]ChangHHY,PannunzioNR,AdachiN,etjoiningandalternativepathwaystodouble-strandbreakrepair[J].NatRevMolCellBiol,2017,18(8):495-506.DOI:10.1038/nrmifichomozygousandheterozygousmutationsusinre,2016,533(7601):125-129.DOI:10.1038/nat[11]JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,etal-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunit2012,337(6096):816-821.DOI:10.1126/science.1225829.[12]KomorAC,KimYB,PackerMS,etal.ProgrammableeditingofatargetbaseingenomicDNAwithoutdouture,2016,533(7603):420-424.DOI:10.1038/nature17946.[13]SamarasingheKTG,Jaime-FigueroaS,BurgerTArgetingChimeras[J].CellChemBiol,2021,28(5):648-661.eI:10.1016/j.chembiol.202[14]LiK,CrewsCM.PROTACs:ev,2022,51(12):5214-5236.DOI:10R/dCas9SystemforGeneExpressionRegulationinNeurons[J2021,8(4):ENEURO.0188-0121.DOI:10.1523/eneuro.0188-21.2021.cell-specificenhancers[J].Immunity,2022,55(3):557-574.e7.DOI:nctionalvariantrs2076295regulepithelialcells[J].AmJRespirCritCareMed,2020,202(9):1225-[18]LiJ,HuangC,XiongT,etal.ACRISPRinvitro[J].IntJBiolSci,2019,15bs.32332.breastcancercells[J].MolCancer,2022,21(1):38.DOI:10.1186/sy[J].Oncogene,2021,40(15):2803-2815.DOI:10.1038/RNAscreensinneurCellGenom,2022,2(11):100177.DOI:10.1016/j.xgen.2022.100177.[22]CámaraE,LenitzI,NygardY.ACRISPRactivationandinterferencetoolkitforindustrialSacchaSciRep,2020,10(1):14605.DOI:10.1038/s41[23]McGlincyNJ,MeachamZA,ReynaudKK,etalPRinterferenceguidelibraryenablesinginyeast[J].BMCGenomics,2021,22(1):205.DOI:10.1186/s12864[24]BaumgartenS,BryantJM,Sinhaamicsofextensivem(6)Ammblood-stagedevelopment[J].NatMicrobiol,2019,4(12):2246-2259.DOI:10.1038/s41564-019-0521-7.[25]BrackettK,MungaleA,Lopez-IsidroM,etal.Ccoma-associatedherpesvirumor-suppressorDNAboundaryelement[J].Cell,2018,173(6):1398-14PLoSGenet,2018,14(11):e1007749.DOI:10.1371/journalor[J].SciTranslMed,2022,14(662):eabj8670.DOI:10.1126/scitrans[J].JNeurosciRes,20SPR-Cas9-mediatedtargetedgener18,26(7):1818-1827.DOI:10.1016/j.ymthyviaCRISPR-Cas9mediatedcellularreprogramminginrodphotoreceptors[J].CellRes,2017,27(6):830-833.DOI:10.1038/cr.201[32]ThakorePI,KwonJB,Nommun,2018,9(1):1674.DOI:10.1038/s41467-humaniPSC-derivedmicrogliauncoversreg[34]SchogerE,ZimmermannWH,CyganekL,etal.Establishmentoftworipotentstemcell(hiPSC)linesfortitratableendogenousgenssion[J].StemCellRes,2021,55:102473.DOI:10.101patientswithDownsyndrome[J].JClinInveshealing[J].Biomaterials,2020,252:120094.DOI:10.1016/ntrollableP(3HB-co-4HB)biosynthesis[J].MetabEng,2015,2-168.DOI:10.1016/j.ymben.2015.03.013.45:32-42.DOI:10.1016/j.ymben.2017.11.010.ncingofabiosyntheticmevalonatepathwayincreasesterpenoidproduction[J].MetabEng,2016,38:228-240.DOI:10.1016/j.ymben.2[40]LiangJL,GuoLQ,LinosylvinusingcombinatorialbioeWorldJMicrobiolBiotechnol,2016,32(6):102.DOI:10.100[41]GauttamR,SeiboldGM,Muellerteriumglutamicum[J].Plasmid,2019,103:25-35.DOi:10.1016/j.plainterferenceinmycobacteria[J].NatCommun,2015,6:62etoinvestigatetheconphagemodelofMycobacteriumtuberculosisinfection[J].JAntimicrobChemother,2022,77(3):615-619.DOI:10.1093/jac/dkab437.噬细胞侵染实验[J].复旦学报(自然科学版):1-10.DOI:10.15943/ki.[45]GaniZ,BoradiaM,KumarA,etal.Mycobacteriumtubercullyceraldehyde-3-phosphatedehydrohesinandasar23(5):el3311.DOI:10.1111/cmi.13311.y-resistantMycobacteriumtuberculosisBeijingstrainupregulatesKatGtoevadestarvation-inducedautophagicres2022,80(1):ftac004.DOI:10.1093/fenaquinone,functionsasaninducerofgenesregulatedbytheMycobacteriumsmegmatisrepressorMSMEG_2295[J].Microb2,168(5):001192.DOI:10.1099/mic.0.001192.[48]AgarwalN.ConstructionofacingofmultiplegenesinMycobacteriumtuberculosis20,110:102515.DOI:10.1016/j.plasmid.2020.102515.[49]LiYY,LiuHM,WriummarinumvirulencebysuppressinghosFrontImmunol,2022,13:879775.DOI:10.3389/fimmegmatis[J].MicrobiolSpectr,2021,9(3):e0000921.DOI:10.1128/Sctrum.00009-21.及表型分析[J].中国生物工程杂志，2021,41(6):13-22.DOI:10.13523/j.c[53]Alvarez-ErasoKLF,MutoryimpactofthesRNAMcrllintwoclinicalisolatesumtuberculosis[J].CurrMicrobiol,2022,79(2):39.DOI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