第十六章 DNA复制课件

第十六章DNA复制和修复生物化学DNAReplication第十六章DNA复制EmphasisDNA复制的特点复制的关键酶DNA修复机制DNA重组的方式生物化学DNAReplication第十六章DNA复制ContentDNA复制DNA的损伤和修复逆转录DNA重组生物化学DNAReplication第十六章DNA复制复制的类型复制的特点复制的起点和单位DNA聚合反应的关键酶DNA复制过程原核细胞与真核细胞的复制比较1、DNA复制生物化学DNAReplication第十六章DNA复制直线双向复制多起点双向复制θ型双向或单向复制滚动环复制D－环复制2D－环复制生物化学DNAReplication（1）复制的类型第十六章DNA复制（2）复制的特点半保留复制半不连续复制对称或不对称复制生物化学DNAReplication第十六章DNA复制保留义：子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代DNA分子半保留：另一条新合成意义？生物化学DNAReplicationI、半保留复制第十六章DNA复制II、半不连续复制滞后链前导链生物化学DNAReplication第十六章DNA复制复制子：replicon，基因组能独立进行复制的单位，含有控制复制起点和终点；真核复制子长度100-200kb。复制方向：大多数双向，少数单向，又可分为对称（双链同时复制）和不对称（先后复制）两种复制方式。复制速度:

复制叉（生长点）的前进速率（恒定），取决于起始频率。原核快（细菌50kbp/min,E.coli），真核慢（1-3kbp/min）？（3）复制的起点和单位生物化学DNAReplication第十六章DNA复制（4）DNA聚合反应有关酶－聚合酶反应可逆；仅能催化加入dNTP，不能使链间连接；大部分复制需要要引物链RNA：只能催化脱氧核糖核苷加入到已有的核酸链的游离3‘-OH，不能从头合成DNA。意义（减少复制差错）模板指导型酶：加入的核苷由模板链决定，与DNA聚合酶的来源和dNTP无关；方向：5’－3’具有校对功能：外切酶活性生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附1：

E.coli

的DNA聚合酶DNA聚合酶I酶II酶III分子量109k120k400k每个细胞的分子数40010010-205‘－3’聚合作用+++3‘－5’外切作用+++5‘－3’外切作用+-+转化率10.0550结构基因polApolBpolC,dnaN(X,Z,Q)生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附2：

E.coli的DNA聚合酶III组成亚基分子量亚基数目功能α140k15’－3’聚合能力核心酶,polIII，活力低，仅作用缺口双链DNApolIII’，ε25k1校对功能，提高保真性。θ10k2τ83k1可利用带有引物的长单链DNAγ52k2延长因子天然的聚合酶III，polIII*δ32k1延长因子β37k1与引物识别和结合有关全酶生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附3：真核DNA聚合酶聚合酶α聚合酶β聚合酶γ聚合酶δ分子量110k-220k45k60k122k亚基数N111细胞内分布细胞核细胞核胞核和线粒体细胞质酶比活力-80%10–15%2–15%10–25%外切酶活力无无无3‘－5’生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附：依赖于外切酶的复制校对生物化学DNAReplication第十六章DNA复制（4）DNA聚合反应有关酶－连接酶催化链间两个末端之间的共价连接，连接切口；耗能：大肠杆菌NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）；动物细胞和噬菌体ATP。对模板链的要求：大肠杆菌连接酶（所连接的链要由互补链将它们聚在一起，形成双螺旋结构）；T4DNALigase不需要模板，且可连接无单链粘性末端（平头）双链DNA。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制（5）DNA复制的过程过程：引发－延伸－终止引发：复制起始DNA解螺旋，转录激活合成引物RNA，前导链和滞后链开始合成延伸：由螺旋酶+拓扑酶解开双螺旋，聚合酶催化复制叉前进终止：可能在终止区终止复制（不一定DNA全序列复制），并连接片段关键：DNA的双螺旋（局部）拆分成两条单链参与物质：酶、蛋白质因子、dNTP、ATP、模板DNA见：FLASH－DNA复制生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附:

参与复制的必要物质蛋白质因子：起始因子、延伸因子、终止因子生物化学DNAReplication第十六章DNA复制螺旋酶Helicase：与DNA单链和ATP结合，借助ATP水解产生的能量促使DNA在复制叉处打开双链生物化学DNAReplication第十六章DNA复制单链DNA结合蛋白(SSBP)：在细胞内能很快地和单链DNA结合，防止模板链重新形成双链或被核酸酶降解。

生物化学DNAReplication第十六章DNA复制DNA拓扑异构酶Topisomerase：将负超螺旋引入DNA分子。（负超螺旋的存在可使DNA双链碱基打开所需能量降低4.1KJ/mol，有利于DNA的双链分开。负超螺旋是DNA复制的必需条件。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制引物酶Primase和RNA聚合酶RNAPolymerase两者的区别：引物酶对雷米封不敏感，而RNA聚合酶则敏感引物酶既可以利用核糖核苷酸，而RNA聚合酶只能利用核糖核苷酸引物酶只在复制起点处合成RNA引物而引发DNA的复制，而RNA聚合酶则是启动DNA转录合成RNA从而将遗传信息由DNA传递到RNA。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制（6）原核细胞和真核细胞复制的比较原核细胞真核细胞复制子单复制子多复制子复制速度快，50000bp/min慢,103bp/min复制方式不对称或对称式对称式复制方向单向或双向双向生物化学DNAReplication第十六章DNA复制2、DNA的损伤和修复DNA的损伤与变异DNA损伤的典型类型引起DNA损伤的因素DNA的修复生物化学DNAReplication第十六章DNA复制DNA变异及其意义：DNA结构的改变将导致相应蛋白质一级结构（氨基酸顺序）的变化，从而引起生物特征或性状发生变异，可引起生物突变各致死。但一切生物的变异和进化都是由于DNA结构的变异结果。变异的种类：自发突变（突变率极低，E.coli10-10）和人工诱变引起DNA变异（或损伤）的原因：物理因子或化学诱变剂（1）DNA的变异与损伤生物化学DNAReplication第十六章DNA复制某个碱基被调换，如A＝T换成G－C；（2）DNA损伤的典型类型UV照射形成二聚体突变；

一段DNA的插入或删除引起的突变；生物化学DNAReplication第十六章DNA复制紫外线（UV）：大剂量紫外线（260nm±）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体（如：TT）。X-射线以及放射性物质：产生的辐射具有很高的能量，直接引起DNA物理或化学性质的改变。高能射线和电离辐射：使DNA周围环绕的其它分子（主要是水）产生具有很高活性的自由基，与DNA分子反应，导致DNA结构发生变化。（3）引起DNA损伤的因素－物理因素生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附1：光聚合反应

胸腺嘧啶碱基

T在紫外光照射下，可生成二聚体T＝T，其结果是破坏了正常复制或转录。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制化学因素是引起DNA结构发生变化的最常见因素主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等。烷基化试剂：能够与DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA。碱基上有多个位置及DNA链上磷酸二酯键中的氧容易被烷基化，从而导致DNA链的断裂。化学因素生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附1：烷基化反应由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转变为稳定的烯醇醚。鸟嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鸟嘌呤核苷后，不再与C配对，而与T配对。这种情况将引起DNA的复制、转录及信息表达出现错误。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附2：亚硝酸对环外氨基的作用

胞嘧啶核苷生成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷可形成次黄嘌呤核苷和黄嘌呤核苷结果：将影响或改变碱基形成氢键的能力和方向，导致DNA复制错误，是引起基因突变的重要原因之一。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制DNA修复系统：光复活切除修复重组修复诱导修复和应急反应（SOS）（3）DNA的修复生物化学DNAReplication第十六章DNA复制I、光复活机制：可见光（400nm）激活光复活酶分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。特点：高度专一性，只修复由UV引起的嘧啶二聚体。仅存在于低等单细胞生物至鸟类，高等哺乳动物不具备，被“暗修复”所替代。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制发生的原因：UV，电离辐射、化学诱变剂（烷化剂）机制：在系列酶的作用下，将DNA的受损部分切除，并以完整的单链为模板，合成切去的部分，使DNA双链恢复正常。参入的酶：内切酶、外切酶、聚合酶、连接酶。特点：属暗修复的复制前修复模式。生物化学DNAReplicationII、切除修复第十六章DNA复制机制：在系列酶的作用下，将DNA的受损部分先复制，并在受损部位产生缺口，使复制完成后，再切除母链相应部分修补子链的缺口，然后重新修复母链的切除部分。参入的酶：内切酶、外切酶、聚合酶、连接酶。特点：属暗修复的复制后修复模式，先复制后修复，并可通过“复制稀释作用”消除影响（P349）。生物化学DNAReplicationIII、重组修复第十六章DNA复制机制：在DNA受损后，诱导与修复系统有关的内切酶、外切酶、聚合酶和连接酶的合成，进而启动和促进修复作用。特点：属诱导型反应。生物化学DNAReplicationIV、应急反应和诱导修复第十六章DNA复制特点：以RNA为模板合成DNA，可能与细胞癌变有关逆转录酶：1970，Temin&Baltimore首先发现。注：放线菌素D可专一抑制致癌RNA病毒的复制，但不能抑制一般病毒的复制，如何理解？逆转录酶的组成和功能：由α和β亚基组成，属多功能酶。可利用RNA为模板合成互补DNA，形成RNA-DNA杂交分子；还能够在新合成的DNA链上合成互补DNA链，形成双链DNA；具有核糖核酸酶H

的活力（能专一水解RNA-DNA杂交分子中的RNA，并可沿着3‘-5’和5‘-3’两个方向的产生核酸外切活力）。3、逆转录生物化学DNAReplication第十六章DNA复制附：反转录的过程生物化学RNA

Synthesis第十六章DNA复制4、DNA重组重组的生物学意义同源重组特异位点重组转座重组生物化学DNAReplication第十六章DNA复制（1）DNA重组的生物学意义DNArecombination:DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组成，又为

Geneticrecombination\generearrangement.突变和重组的生物学意义：产生遗传的变异的基础，而生物进化以不断产生可遗传的变异为基础，即:首先由Mutation&Recombination

产生遗传的变异，然后出现Geneticdrift

和Natureselection，在此基础上产生

Evolution。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制DNA重组的生物学意义：突变的机率很低，并且多数突变是有害的，因此如果生物只有突变没有重组，则不可避免积累许多难以摆脱的不利突变，造成有利的突变与有害的突变一起被淘汰，即新的优良基因不可能出现或遗传；重组可以迅速增加群体的遗传多样性（diversity），分离有害突变和有利突变，即通过优化组合积累有意义的遗传信息；重组还参与DNA的损伤或复制障碍的修复：如重组修复生物化学DNAReplication第十六章DNA复制

2002,日本科学家们，任意区域重组预测，这一新发现将能够迅速、高效地改良“冷区域”中一些利用杂交技术也改良不了的遗传性状。并且，这种方法利用了生物本身具备的基因重组机制，与普通的基因重组比起来，舆论的压力和消费者的抵触情绪都要小。

附1：DNA重组的研究进展生物化学DNAReplication第十六章DNA复制美国哈佛医学院，2004《科学》：线粒体DNA分子也会发生DNA片断交换和重组，可能对以前的一系列科研成果造成冲击，涉及人类的进化、原始人类的迁徙，乃至各种人类语言之间的关系。人的线粒体都来自母亲，现代人的线粒体来自于约15万年前的一位女性－－“线粒体夏娃”。科学家认为，线粒体DNA分子相对稳定，不会互相交换DNA片断，造成它们发生变化的唯一因素是自发变异－－以相对稳定的速率进行并积累，可为“分子钟”使用。两个人的线粒体DNA的差异程度，就决定了他们最近的母系共同祖先生活时期。但在几年前，人们发现了一个罕见的例外，一名男子的线粒体DNA部分来自父亲。试验表明：负责复制线粒体DNA的酶停止复制母亲的DNA、跳到父亲的DNA上从对应的位置开始复制时，就发生了线粒体DNA的重组。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制（2）Homologousrecombination染色体减数分裂期同源重组，细菌接合，和细胞融合。

HollidayModel

(RobinHolliday,1964)两个同源染色体DNA排列整齐；一个DNA和一条链裂断并与另一个DNA对应的链连接，形成jointmolecule,即HollidayIntermediate;通过分支移动产生异源双链DNA；HollidayIntermediate切开并修复，形成2DSrecombinantDNA生物化学DNAReplication第十六章DNA复制同源重组的特点：切开的方式不同所得到的重组产物不同，可分别得到“片段重组体（异源DNA两侧来自同一亲本DNA）”和“拼接重组体（异源DNA两侧来自不同亲本DNA）”DNA同源重组的分子基础是链间碱基配对，是十分精确的过程，若出现一个核苷酸的差错都会造成基因失活同源性并不意味着序列完全相同，两个DNA分子只要含有一段碱基序列大体类似的同源区，则可能发生重组。但重组的两DNA分子必需具有

75bp以上的同源区才能发生同源重组，否则将显著降低重组率。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制（3）Site-specificrecombination特异位点重组：一般发生在20-200bpDNA序列内（重组位点），需要重组酶和辅助因子对重组位点进行识别和作用。特点：重组的结果决定于重组位点的位置和方向（重组位点以相反\同方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位\切除）参与生物过程：某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，某些病毒和质粒DNA复制循环过程中的融合与切除等（如：噬菌体与宿主，细菌特异位点重组，免疫球蛋白基因重排）。生物化学DNAReplication第十六章DNA复制（4）转座重组转座子（transposon）：可发生transposition的

DNA，即一种可以由染色体一个位置转移到另一个位置的遗传因子转座子的特点：当它插入基因内时，该基因失活，若为重要基因则致死；受控，频率很低；寄生于基因组，目的为自我扩增（方式：复制转座和转座后随染色体复制）。对基因组是不稳定因素，可导致宿主序列删除、倒位或易位；可在基因组中可移动；生物化学DNAReplication第十六章DNA复制I、细菌的转座子两种类型：IS插入序列和Tn复杂转座子插入序列（IS）：最简单的转座子，仅有转座基因，无标记基因；序列两端都有反向重复（序列类似，并非完全相同），重复序列

15~25bp（供转座酶识别）；不同转座子的转座频率不同，一般一世代转座频率为10-3~10-4；要借助插入位点基因的失活、分子杂交或测序来检测生物化学DNAReplication第十六章DNA复制复杂转座子（Tn）：含转座酶基因各各种标记基因，易检测。根据结构分为两类：组合因子和复合因子。组合因子：由个别模件组合而成，一般插入序列作为两臂，中间为标记基因；复合因子：含有转座酶基因（取代插入序列）、解离酶基因和标记基因，两端为38bp反向重复序列，无插入序列。中心区臂R\ISR臂L\ISL两臂正向中心区臂R\ISR臂L\ISL两臂反向生物化学DNAReplication第十六章DNA复制II、细菌的转座过程与效应共同过程：转座酶识别转座子的A

末端反向重复序列，并在A-3’

末端切开，同时在靶部位B

交错切开单链，B-5’末端与

A-3’连接，形成ShapiroIntermediate;分歧：后续过程按转座子是否复制可分为“非复制转座\保留性转座”－（transposon从原来位置切除转入新的位置，两条链都保留）和“复制转座”－（在形成靶部位的TI进行复制，获得新的T，受体T和给体T连在一起形成“共整合体”，然后通过重组将二者拆开）生物化学DNAReplication第十六章DNA复制生物化学DNAReplication第十六章DNA复制III、真菌的转座子McClintock,1983theNobelPrize,Corntransposon.可对染色体产生不稳定的诱变效应，进而影响某些遗传性状，故又称“控制因子”类似于原核生物，但由于真核生物的转录和翻译过程在时空上被核结构所分隔，故真核细胞内任何可被转座酶所识别的反向重复末端均可发生转移，而不需要被转移序列自身编码转座酶。原核生物转座酶主要作用于它的转座子，表现出顺式显性，而真核生物无此特征。玉米中的三个转座子系统：激活－解离系统，抑制－促进－增燮系统，斑点系统（自学）生物化学DNAReplication第十六章DNA复制IV、转座子的研究和应用1990’s研究发现，猫有一个和猴子非常近的基因，是500万到1000万年前由狒狒“转移”给猫；另贾第鞭毛虫体内的细菌基因，结论为物种