表观遗传学专题培训讲座专家讲座

表观遗传学

（epigenetics）表观遗传学专题培训讲座第1页表观遗传学专题培训讲座第2页表观遗传学专题培训讲座第3页Epigeneticdifferences：monozygotictwins表观遗传学专题培训讲座第4页遗传类型1.遗传编码信息：提供生命必需蛋白质模板2.表观遗传学信息：何时、何地、以何种方式去应用遗传信息表观遗传学专题培训讲座第5页遗传信息传递：中心法则1.DNA本身经过复制传递遗传信息；2.DNA转录成RNA；3.RNA本身能够复制(RNA病毒)；4.RNA能够逆转录成DNA；5.RNA翻译成蛋白质。表观遗传学专题培训讲座第6页表观遗传学(epigenetics)1.概念基因DNA序列不发生改变情况下，基因表示水平与功效发生改变，并产生可遗传表型。2.特征(1)可遗传(2)可逆性(3)DNA不变表观遗传学专题培训讲座第7页88遗传与表观遗传表观遗传学专题培训讲座第8页99基因组与表观基因组表观遗传学专题培训讲座第9页1942年沃丁顿(Waddington)在Endeavour杂志首次提出表观遗传学。基因型遗传(heredity)或传承(inheritance)是遗传学研究主旨,而基因型产生表型过程则是属于表观遗传学研究范围。研究历史表观遗传学专题培训讲座第10页1987年,霍利德(Holliday)深入指出可在两个层面上研究高等生物基因属性。第一个层面是基因世代间传递规律——遗传学。第二个层面是生物从受精卵到成体发育过程中基因活性改变模式——表观遗传学。表观遗传学研究“上代向下代传递信息,能够经过有丝分裂或减数分裂而遗传下去基因功效改变，而不是DNA序列本身”,这是一个“不以DNA序列差异为基础细胞核遗传”。表观遗传学专题培训讲座第11页三个层面调控基因表示：DNA修饰：DNA共价结合一个修饰基团，使含有相同序列等位基因处于不一样修饰状态。蛋白修饰：经过对特殊蛋白修饰或改变蛋白构象实现对基因表示调控。非编码RNA调控：经过一些机制实现对基因转录调控，如RNA干扰。意义：任何一个层面异常，都将影响染色质结构和基因表示，造成复杂综合征、多原因疾病以及癌症。和DNA序列改变不一样是，许多表观遗传改变是可逆，这就为疾病治疗提供乐观前景。表观遗传学专题培训讲座第12页表观遗传学研究内容基因选择性转录表示调控DNA甲基化基因印记组蛋白共价修饰染色质重塑基因转录后调控基因组中非编码RNA微小RNA（miRNA）反义RNA内含子、核糖开关等表观遗传学专题培训讲座第13页14表观遗传学机制DNA甲基化114组蛋白修饰2染色质重塑3RNA调控4DNA甲基化1表观遗传学专题培训讲座第14页

(Probstetal.NatRev)表观遗传学专题培训讲座第15页Thursday,May16,202416一、DNA甲基化Thursday,May16,2024

DNA甲基化(DNAmethylation)是研究得最清楚、也是最主要表观遗传修饰形式，主要是基因组DNA上胞嘧啶第5位碳原子和甲基间共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。DNMT1SAM胞嘧啶5-甲基胞嘧啶胞嘧啶甲基化反应

16S-腺苷甲硫氨酸表观遗传学专题培训讲座第16页DNA甲基化转移酶DNMT1

作为DNA复制复合物组分，催化子链DNA半甲基化位点甲基化，维持复制过程中甲基化位点遗传稳定性。DNMT3a和DNMT3b

主要催化从头甲基化，以非甲基化DNA为模板催化新甲基化位点形成。表观遗传学专题培训讲座第17页基因调控模型1.DNA甲基化主要功效：转录缄默(1)基因开启子区域通常不被甲基化修饰(2)建立特定基因表示模式：组织特异性、生殖特异性…(3)基因组印记、X染色体失活2.DNA甲基化抑制基因转录机制：(1)干扰转录因子对DNA元件识别和结合(2)将转录因子DNA识别序列转变为阻抑物识别序列(3)DNA甲基化有利于招募染色质重塑或修饰因子3.DNA甲基化：是转录缄默结果和维持，而不是原因。表观遗传学专题培训讲座第18页19一、DNA甲基化哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量2%-7%，约70%5mC存在于CpG二连核苷。在结构基因5’端调控区域,CpG二连核苷经常以成簇串联形式排列，这种富含CpG二连核苷区域称为CpG岛(CpGislands)，其大小为500-1000bp，约56%编码基因含该结构。基因调控元件(如开启子)所含CpG岛中5mC会妨碍转录因子复合体与DNA结合。DNA甲基化普通与基因缄默相关联；非甲基化普通与基因活化相关联；而去甲基化往往与一个缄默基因重新激活相关联。19表观遗传学专题培训讲座第19页Thursday,May16,202420一、DNA甲基化Thursday,May16,2024205’3’CpG岛主要处于基因5’端调控区域。开启子区域CpG岛普通是非甲基化状态，其非甲基化状态对相关基因转录是必须。当前认为基因调控元件（如开启子）CpG岛中发生5mC修饰会在空间上妨碍转录因子复合物与DNA结合。因而DNA甲基化普通与基因缄默相关联。Rb基因CpG频率表观遗传学专题培训讲座第20页DNA甲基化抑制基因转录机制基因开启子区甲基化可影响转录激活因子和其识别序列结合，直接抑制基因表示。甲基化CpG双核苷酸序列可被甲基结合蛋白家族(MBD)识别，而后者经过吸引组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和组蛋白甲基化转移酶(HMT)等组蛋白修饰蛋白来改变染色质活性，间接影响基因表示。表观遗传学专题培训讲座第21页直接干扰机制(1)表观遗传学专题培训讲座第22页直接干扰机制(2)表观遗传学专题培训讲座第23页间接机制Themethyl-CpG-bindingproteinsMeCP1andMeCP2能够与甲基化DNA结合MeCP2能够招募Sin3a,HDACs，形成复合物，阻遏转录表观遗传学专题培训讲座第24页MeCP2表观遗传学专题培训讲座第25页Modelformethylation-dependentgenesilencing.Thestructuralelementofchromatinisthenucleosomalcore,whichconsistsofa146-bpDNAsequencewrappedaroundcorehistones.Acetylationofthehistonescausesanopenchromatinconfig-urationthatisassociatedwithtranscriptionalactivity.Methylatedcytosinesarerecognizedbymethyl-CpG-bindingproteins(MBDs),whichinturnrecruithistonedeacetylases(HDACs)tothesiteofmethylation,convert-ingthechromatinintoaclosedstructurethatcannolongerbeaccessedbythetranscriptionalmachinery.表观遗传学专题培训讲座第26页DNA甲基化状态遗传和保持：DNA复制后，新合成链在DNMT1作用下，以旧链为模板进行甲基化。（缺乏严格准确性，95%）甲基化并非基因缄默原因而是基因缄默结果，其以某种机制识别缄默基因，后进行甲基化。DNA全新甲基化。引发原因可能包含：DNA本身序列、成份和次级结构。RNA依据序列同源性可能靶定区域。特定染色质蛋白、组蛋白修饰或相当有序染色质结构。表观遗传学专题培训讲座第27页Thursday,May16,202428DNA去甲基化主动去甲基化复制相关去甲基化在复制过程中维持甲基化酶活性被关闭或维持甲基化酶活性被抵制。一、DNA甲基化Thursday,May16,202428表观遗传学专题培训讲座第28页DNA甲基化检测方法1.甲基化敏感限制性内切酶法2.基于亚硫酸氢盐修饰方法3.基于甲基化DNA特异结合富集方法表观遗传学专题培训讲座第29页二、组蛋白修饰表观遗传学专题培训讲座第30页组蛋白修饰是表观遗传研究主要内容。组蛋白N端是不稳定、无一定组织亚单位，其延伸至核小体以外，会受到不一样化学修饰，这种修饰往往与基因表示调控亲密相关。被组蛋白覆盖基因假如要表示，首先要改变组蛋白修饰状态，使其与DNA结合由紧变松，这么靶基因才能与转录复合物相互作用。所以，组蛋白是主要染色体结构维持单元和基因表示负控制因子。表观遗传学专题培训讲座第31页组蛋白修饰种类乙酰化--普通与活化染色质构型相关联，乙酰化修饰大多发生在H3、H4Lys残基上。甲基化--发生在H3、H4Lys和Arg残基上，能够与基因抑制相关，也能够与基因激活相关，这往往取决于被修饰位置和程度。磷酸化--发生与Ser残基，普通与基因活化相关。泛素化--普通是C端Lys修饰，开启基因表示。SUMO（一个类泛素蛋白）化--可稳定异染色质。其它修饰（如ADP核糖基化）表观遗传学专题培训讲座第32页BryanM.Turner,naturecellbiology,组蛋白中被修饰氨基酸种类、位置和修饰类型被称为组蛋白密码（histonecode），遗传密码表观遗传学延伸，决定了基因表示调控状态，而且可遗传。表观遗传学专题培训讲座第33页主要功效基团AcetylMethylPhosphorylUbiquitin表观遗传学专题培训讲座第34页组蛋白共价修饰表观遗传学专题培训讲座第35页组蛋白修饰表观遗传学专题培训讲座第36页组蛋白修饰(2)表观遗传学专题培训讲座第37页组蛋白乙酰化1.通常发生在蛋白质赖氨酸(K)上；2.可逆生化反应：A.Histoneacetyltransferase，HAT(>30)B.Histonedeacetylase,HDAC(18)3.分子效应：中和赖氨酸上正电荷，增加组蛋白与DNA排斥力4.生物学功效：A.基因转录活化B.DNA损伤修复表观遗传学专题培训讲座第38页组蛋白甲基化1.主要发生在赖氨酸(K)或精氨酸(R)上；2.Long-term；3.HKMTs(histonelysinemethyltransferases)vs.PRMTs(proteinargininemethyltransferases)4.可逆生化反应?5.分子效应：增加赖氨酸上疏水力6.生物学功效：A.基因转录活化B.基因转录缄默C.X染色体失活D.异染色质致密状态(heterochromatincompaction)表观遗传学专题培训讲座第39页组蛋白乙酰化、甲基化以及DNA甲基化关系A.MBD结合甲基化DNA,招募HDAC,组蛋白去乙酰化,招募HMT,甲基化组蛋白,转录缄默；B.组蛋白无乙酰化修饰,MBD结合甲基化DNA,再与SET结合，甲基化组蛋白C.甲基化组蛋白尾部招募DNMT，对基因长久缄默表观遗传学专题培训讲座第40页组蛋白SUMO化1.通常发生在赖氨酸(K)上；2.可逆生化反应：A.E1,E2,&E3B.SENPs3.生物学功效：A.转录缄默B.抑制组蛋白乙酰化和甲基化表观遗传学专题培训讲座第41页组蛋白共价修饰功效基因转录、DNA损伤修复、DNA复制、染色体凝聚等表观遗传学专题培训讲座第42页组蛋白修饰检测方法1.免疫染色2.染色质免疫共沉淀3.质谱表观遗传学专题培训讲座第43页三、染色质重塑染色质重塑（chromatinremodeling）是一个主要表观遗传学机制。染色质重塑是由染色质重塑复合物介导一系列以染色质上核小体改变为基本特征生物学过程。组蛋白尾巴化学修饰（乙酰化、甲基化及磷酸化等）能够改变染色质结构，从而影响邻近基因活性。表观遗传学专题培训讲座第44页核小体表观遗传学专题培训讲座第45页核小体定位是核小体在DNA上特异性定位现象。核小体关键DNA并不是随机，其具备一定定向特征。核小体定位机制：内在定位机制：每个核小体被定位于特定DNA片断。外在定位机制：内在定位结束后，核小体以确定长度特征重复出现。核小体定位意义：核小体定位是DNA正确包装条件。核小体定位影响染色质功效。表观遗传学专题培训讲座第46页染色质重塑染色质(Chromatin):染色体上高度致密部分，通常不表示基因表观遗传学专题培训讲座第47页常染色质与异染色质1.常染色质：基因表示活跃区域，染色体结构较为疏松2.异染色质：基因表示缄默区域，染色体结构致密核小体常染色质异染色质表观遗传学专题培训讲座第48页染色体上不一样区域Euchromatin:常染色质；Heterochromatin:异染色质E->H或H->称为染色质重塑(ChromatinRemodeling)分子机理：DNA甲基化，组蛋白修饰，染色质重塑复合物协同作用。表观遗传学专题培训讲座第49页染色质重塑假设步骤1.两类酶调控染色质重塑过程：组蛋白修饰因子(histonemodifiers)以及ATP依赖染色质重塑因子(chromatinremodelers)2.组蛋白修饰因子并不改变核小体位置，而是在DNA上作标识，以招募其它活性成份(组蛋白密码)3.染色质重塑因子：水解ATP释放能量，从而改变染色质结构4.染色质重塑因子复合物表观遗传学专题培训讲座第50页Ch11openerp447染色质重塑因子核小体染色质重塑因子与核小体相互作用表观遗传学专题培训讲座第51页组蛋白乙酰转移酶结合活化对应区域去凝聚状态染色质活性染色质产生表观遗传学专题培训讲座第52页组蛋白乙酰化酶染色质重塑复合物组蛋白去乙酰化酶染色质重塑复合物表观遗传学专题培训讲座第53页Mediator-PolII复合物：识别活化区域表观遗传学专题培训讲座第54页OFFONtrxG保持活性状态(openchromatin)PRETargetgene组蛋白乙酰化和甲基化(TAC1andASH1complexes)组蛋白去乙酰化和甲基化(ESC-E(Z)complex)保持缄默状态(compactchromatin)PcG染色质重塑-H2AUbiquitination(PRC1complex)染色质重塑(BRMcomplex)AcMeK27H3MeK4H3UbH2APc-Gvs.trx-G：作用机制表观遗传学专题培训讲座第55页染色质修饰与重塑（共价修饰型与ATP依赖型）表观遗传学专题培训讲座第56页（A）结合（B）松链（C）重塑八聚体转移八聚体滑动+ATP重塑复合物ATP依赖染色质重构机制表观遗传学专题培训讲座第57页四、RNA调控1995，RNAi现象首次在线虫中发觉。1998，RNAi概念首次提出。1999，RNAi作用机制模型提出。在线虫、果蝇、拟南芥及斑马鱼等各种生物内发觉RNAi现象。，RNAi技术成功诱导培养哺乳动物细胞基因缄默现象。RNAi技术被《Science》评为年度十大科技进展之一。至今，蓬勃发展，成为分子生物学领域最为热门方向之一。表观遗传学专题培训讲座第58页RNA干扰（RNAi）作用是生物体内一个经过双链RNA分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因缄默过程。因为RNAi发生在转录后水平，所以又称为转录后基因缄默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）。RNA干扰是一个主要而普遍表观遗传现象。表观遗传学专题培训讲座第59页

siRNAsiRNA结构：21-23nt双链结构，序列与靶mRNA有同源性，双链两端各有2个突出非配正确3’碱基。siRNA功效：是RNAi作用主要组分，是RNAi发生中介分子。内源性siRNA是细胞能够抵抗转座子、转基因和病毒侵略。表观遗传学专题培训讲座第60页siRNA介导RNAi表观遗传学专题培训讲座第61页siRNAi特点：高效性和浓度依赖性特异性位置效应时间效应细胞间RNAi可传输性多基因参加及ATP依赖性表观遗传学专题培训讲座第62页

miRNA结构：21-25nt长单链小分子RNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由含有发夹结构约70-90个碱基大小单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。特点：含有高度保守性、时序性和组织特异性。功效：表观遗传学专题培训讲座第63页siRNA介导RNAi表观遗传学专题培训讲座第64页

相同点/联络点siRNAmiRNA长度及特征都约在22nt左右，5’端是磷酸基，3＇端是羟基合成底物miRNA和siRNA合成都是由双链RNA或RNA前体形成Dicer酶依赖Dicer酶加工，是Dicer产物，所以含有Dicer产物特点Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白参加RISC组分二者都是RISC组分，所以其功效界限变得不清楚，如二者在介导缄默机制上有重合；产生了ontarget和offtarget问题作用方式都能够阻遏靶标基因翻译，也能够造成mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用进化关系可能两种推论：siRNA是miRNA补充，miRNA在进化过程中替换了siRNA

表观遗传学专题培训讲座第65页不一样点/分歧点siRNAmiRNA机制性质往往是外源引发，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况是生物体本身一套正常调控机制直接起源长链dsRNA发夹状pre-miRNA分子结构siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UUmiRNA是单链RNA对靶RNA特异性较高，一个突变轻易引发RNAi缄默效应改变相对较低，一个突变不影响miRNA效应作用方式RNAi路径miRNA路径生物合成，成熟过程由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中pri-miRNA在核内由一个称为Drosha酶处理后成为60nt带有茎环结构PrecursormiRNAs(pre-miRNAs)；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟miRNAs；发生在细胞核和细胞质中Argonaute(AGO)蛋白质各有不一样AGO蛋白质各有不一样AGO蛋白质互补性（complementarity）普通要求完全互补不完全互补，存在错配现象RISCs分子量不一样(MartinezandTuschl,;Martinezetal.,;Nykanenetal.,;Phametal.,)siRISCsmiRISCs/miRNP表观遗传学专题培训讲座第66页各自生物学功效不一样ⅰ抵抗病毒防御机制(Pfefferetal.,;Dingetal.,)；ⅱ缄默那些过分表示mRNA；ⅲ保护基因组免受转座子破坏(MelloandConte,Jr.,;Hannon,;Tabaraetal.,1999)-9；对有机体生长发育有主要作用(Rhoadesetal.,)主要特征高度特异性高度保守性、时序性和组织特异性作用机制单链siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，经过其本身解旋酶活性，解开siRNAs，经过反义siRNA链识别目标mRNA片段，经过内切酶活性切割目标片段，接着再经过细胞外切酶深入降解目标片段。同时，siRNA也能够阻遏3′UTR含有短片断互补mRNA翻译（offtarget）。成熟miRNAs则是经过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA翻译。在动物中，成熟单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物经过部分互补结合到mRNA3′UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。除此之外，miRNA也能够切割完全互补mRNA。加工过程siRNA对称地起源于双链RNA前体两侧臂miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA一个侧臂，其它部分降解。对RNA影响降解目标mRNA；影响mRNA稳定性在RNA代谢各个层面进行调控；与mRNA稳定性无关作用位置siRNA可作用于mRNA任何部位miRNA主要作用于靶标基因3´-UTR区生物学意义siRNA不参加生物生长，是RNAi产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染miRNA主要在发育过程中起作用，调整内源基因表示不一样点/分歧点siRNAmiRNA表观遗传学专题培训讲座第67页五、其它表观遗传机制除DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、和RNA调控以外，还有遗传印迹、X染色体失活、转座、负突变等。遗传印迹