家禽病毒病防治-新城疫的防治（禽病防治课件）

1%鸡红细胞悬液制备一、实验目的1、进一步熟练鸡静脉采血方法。2、掌握细胞洗涤的方法步骤。3、掌握1%红细胞悬液配制方法。二、实验器材5ml一次性注射器、酒精棉适量、干棉球适量、10ml离心管、微量移液枪（50ul,1ml,10ml各1支）、移液枪架，微量移液枪滴头（50ul,1ml,10ml各1盒）、托盘天平、低速离心机、500ml烧杯2个、100ml烧杯2个、50ml烧杯4个、生理盐水、3.8%柠檬酸钠三、实验步骤1、采集抗凝血注射器内抽取适量抗凝剂（按1：5比例）鸡保定，暴露抽血部位，消毒（翼下静脉）进针回抽活塞抽取血液拔针，同时用干棉球止血。2、洗涤红细胞将抗凝血放入12ml离心管中。加入3–4倍体积的生理盐水，混匀。2000r/min离心8min。去掉上层血浆和白细胞。重复以上过程，反复洗涤3次（洗净血浆和白细胞）。3、配制1%红细胞悬液吸取压积红细胞用生理盐水配成体积分数为1%的悬液。4℃保存备用。微量血凝试验一、实验目的掌握微量血凝试验的原理和方法步骤。红细胞凝集（HA现象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBC血凝性病毒

有其受体的红细胞RBC血凝素纤突受体v血凝素纤突二、实验原理一些动物红细胞(如鸡、豚鼠等)上有某些病毒受体（如禽流感病毒、新城疫病毒、减蛋综合征等），当红细胞遇到这些病毒就可产生红细胞凝集现象，简称血凝。96孔V型血凝板5-50ul微量移液器微量移液器架5-50ul微量移液器吸头三、实验器材三、实验器材微型振荡器废物缸、废液缸PBS1%鸡红细胞悬液鸡新城疫病毒标准阳性抗原四、方法步骤1.在96孔V型微量反应板的1孔—12孔均加入25ulPBS。四、方法步骤2.吸取25ul抗原(或病毒悬液）加入第1孔，吹打3次-5次，充分混匀。3.从第1孔中吸取25ul悬液至第2孔，混均匀后再吸取25ul悬液至第3孔，依次进行倍比稀释至第11孔，最后从第11孔吸取25ul弃去。第12孔不加抗原或病毒悬液，作为PBS对照。四、方法步骤4.每孔加入25ulPBS。四、方法步骤5.每孔加入25ul体积分数为1％的鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。四、方法步骤6.将微量反应板在微型振荡器振荡混匀或轻扣反应板混匀反应物，室温静置20min-30min或2℃-8℃静置60min，当对照孔（第12孔）红细胞呈显著纽扣状时判定结果。微量血凝试验的操作方法步骤（单位：ul）孔号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水252525252525252525252525病毒液2525252525252525252525弃25生理盐水2525252525252525252525251%红细胞悬液252525252525252525252525振荡混匀结果观察❆❆❆❆❆❆❆❆

微量血凝试验结果判定1、判定时机室温静置20min-30min或2℃-8℃静置60min，当对照孔（第12孔）红细胞呈显著纽扣状时判定结果。2、判定方法将反应板倾斜，观察红细胞有无泪珠状流淌。完全不凝集不完全凝集完全凝集ABC2、判定方法以完全凝集（不流淌）的最高稀释倍数为抗原或病毒的血凝效价。下图抗原或病毒的血凝效价为8log2(1:256)。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。2、判定方法微量血凝抑制试验一、实验目的掌握微量血凝抑制试验的原理和方法步骤。Ag、Ab不对应RBC抗体红细胞凝集（HA现象）RBCvvvvvRBCRBCRBCRBCRBCRBCRBCRBCv血凝性病毒血凝素纤突vvvv

Ag、Ab对应RBC红细胞不凝集（HI现象）RBCvvRBCRBC二、实验原理如有能凝集血球的病毒，其凝集性可被相应的抗体所抑制，这种抑制还有特异性。二、实验原理故病毒的血凝抑制试验也可用已知血清来鉴定未知病毒。可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体。96孔V型血凝板5-50ul微量移液器微量移液器架5-50ul微量移液器吸头三、实验器材三、实验器材微型振荡器废物缸、废液缸PBS1%鸡红细胞悬液鸡新城疫病毒标准阳性抗原新城疫病毒标准阳性血清、阴性血清四、方法步骤1.在96孔V形血凝板第1孔～第11孔各加入25uL

PBS,第12孔加入50ulPBS。四、方法步骤2.吸取25uL血清加入第1孔，充分混匀后移出25uL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，并从第10孔弃除25uL。四、方法步骤4.第1～第11孔各加入25uL4HAU抗原，振荡15S，使液体混合均匀，室温至少静置20min，或2℃-8℃至少60min。四、方法步骤5.在第1孔-第12孔各加入25uL1％的鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。四、方法步骤6.振荡混匀，室温静置20min-40min或2℃-8℃静置40min-60min，当对照孔（第12孔）红细胞呈显著纽扣状时判定结果。四、方法步骤7.第11孔为抗原对照，第12孔为PBS对照，每次测定还应设已知效价的标准阳性血清和阴性血清作对照。抗原对照PBS对照标准阳性血清对照阴性血清作对照微量毒血凝抑制试验的操作方法（单位：mL）孔

号123456789101112血清稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒对照阴性对照生理盐水2525252525252525252525

50被检鸡血清25252525252525252525弃25

4单位病毒2525252525252525252525室温中静置30min0.5%红细胞252525252525252525252525

振荡混匀结果观察❆❆微量血凝抑制试验结果判定1、判定时机室温静置20min-40min或2℃-8℃静置40min-60min，当对照孔（第12孔）红细胞呈显著纽扣状时判定结果。2、判定方法将反应板倾斜，从背侧观察加样孔底部的红细胞是否呈泪痕状流淌。完全不凝集不完全凝集完全凝集ABC2、判定方法以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数为该血清的HI抗体效价。下图血清的HI抗体效价为7log2。只有当阴性血清对照HI抗体效价≤2log2，阳性血清对照HI抗体效价与与标定效价相差≤1个滴度，红细胞对照孔无自凝现象，试验结果有效。HI效价≤3log2，判为HI试验阴性；HI效价≥4log2，判为HI试验阳性。2、判定方法新城疫（ND），又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟。被国家列为动物一类传染病。新城疫病原与流行病学1病原新城疫病毒（NDV），属于副粘病毒科、腮腺炎病毒属的禽副黏病毒。新城疫病毒只有一个血清型。根据对鸡的致病性，病毒株分为三型：速发型（强毒力型）、中发型（中等毒力型）、缓发型（低毒力型）新城疫病毒囊膜上有血凝素，可与鸡等动物的红细胞表面受体结合，引起红细胞凝集（HA）。可用HA试验测定疫苗或分离物中病毒含量。这种血凝特性能被血清中新城疫抗体特异性抑制（HI），HI试验可用于鉴定病毒、诊断疾病和免疫监测。1病原NDV能在鸡胚和多种细胞上生长繁殖尿囊腔接种9-11日龄鸡胚病毒存在于病禽的所有器官组织脑、脾、肺含毒量最高，骨髓带毒时间最长抵抗力不耐热，对PH较稳定，对低温有很强的的抵抗力对消毒药抵抗力弱：常用的消毒药如2%氢氧化钠、5%漂白粉、70%酒精1病原2流行病学易感动物鸡、火鸡、珍珠鸡、野鸡都易感。鸡最易感，其次野鸡。鸽、鹌鹑、观赏鸟也易感。（鸽瘟、鸽1型副黏病毒病）鹅可感染发病。（鹅副黏病毒病）鸭可感染，很少表现症状。野禽、笼养鸟（鹦鹉）多为隐性感染。人也可感染，偶发结膜炎、发热、头痛等症状。传染源：病鸡、带毒鸡、其它鸟类传播途径呼吸道、消化道机械传播者：野禽、外寄生虫、人流行特点不分鸡的品种、年龄，一年四季均可发生在易感鸡群中迅速传播，呈毁灭性流行，在非免疫鸡群，发病率和病死率可达到90%以上非典型新城疫多发生于免疫鸡群2流行病学新城疫防控

1.预防措施：综合性预防措施在做好卫生管理和严格消毒是基础在，科学有效免疫接种是预防本病的关键。合理做好免疫接种建立免疫监测制度（1）合理做好免疫接种

疫苗种类：包括活疫苗和灭活疫苗两类

品系毒力适用年龄免疫方法Ⅰ系中等经弱毒疫苗免疫后鸡或2月龄以上的鸡肌肉注射或刺种Ⅱ系（B1株)弱毒大、小鸡均可滴鼻、点眼、饮水、气雾Ⅳ系（Lasota株）及克隆30弱毒大、小鸡均可滴鼻、点眼、饮水、气雾特点可刺激机体产生体液免疫、细胞免疫和局部免疫，很快产生保护力，首次免疫受母源抗体影响。活疫苗品系免疫方法Lasota株灭活后加入油佐剂制成肌肉或皮下注射鸽1型副黏病毒油乳剂灭活苗肌肉或皮下注射优点安全可靠，容易保存，产生的抗体水平高，维持时间较长。灭活苗和活苗配合使用，效果更好。灭活疫苗日龄疫苗品系免疫方法10日龄Ⅳ系（Lasota株）或克隆30油乳剂灭活苗点眼滴鼻皮下注射半羽份50日龄Ⅳ系（Lasota株）或克隆30气雾免疫17周龄油乳剂灭活苗皮下或肌肉注射以后根据抗体水平的监测，决定是否进行疫苗免疫发现抗体水平参差不齐，立即用Ⅳ系气雾免疫，可持续到鸡淘汰规模化种鸡和蛋鸡场免疫程序：因地制宜日龄疫苗品系免疫方法7-10日龄Ⅳ系（Lasota株）或克隆30点眼滴鼻25-30日龄Ⅳ系（Lasota株）皮下或肌肉注射60日龄Ⅰ系皮下或肌肉注射17周龄油乳剂灭活苗皮下或肌肉注射小鸡场或个体户鸡场日龄疫苗品系免疫方法7-10日龄Ⅳ系（Lasota株）或克隆30点眼滴鼻20日龄Ⅳ系（Lasota株）2-3倍量饮水免疫商品肉鸡（2）建立免疫监测制度定期抽样采血，测定鸡群HI抗体效价根据HI效价，确定首免和再次免疫时间

1：16以上，保护鸡群免于发病死亡低于1：8，马上接种规模化鸡场，尽量确保抗体滴度大于1：642.发病后控制措施怀疑为新城疫，疫情报告确诊后，由政府部门划定疫区，进行扑杀、封锁、隔离和消毒等严格的防疫措施隔离封锁饲养：禁止人员工具向健康鸡舍流动、用火碱水消毒、病鸡无害化处理紧急接种：对疫区和受威胁区的鸡群中没有症状的易感鸡，雏鸡2～4倍IV系+油乳剂苗1羽份；中雏或成鸡2倍Ⅰ系。在最后1只病鸡死亡或扑杀后2周，经全场消毒，解除封锁。新城疫临床诊断1临床症状对鸡新城疫临床症状的描述，有几种不同的分型方法，分别介绍如下：典型最急性型急性型慢性型非典型最急性型：见于暴发初期，鸡群无明显异常，突然出现急性死亡病例。典型新城疫急性型典型新城疫精神沉郁、发热、食欲废绝、饮欲增加。鸡冠、肉髯呈暗红色、紫蓝色或紫黑色嗉囔内充满未消化的饲料和酸臭的液体下痢，粪便呈黄绿色呼吸困难，有啰音，张口伸颈出现神经症状，表现为全身抽搐、扭颈、瘫痪、翅麻痹等。产蛋量