白藜芦醇对重症急性胰腺炎大鼠肝脏的保护作用

1、 作者：沙焕臣，马清涌，JHA Rajiv Kumar，徐复国，马振华 作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 【摘要】 目的 探讨白藜芦醇对实验性重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)大鼠肝功能的保护作用。方法 96只成年雄性SD大鼠随机分为假手术(sham operation, SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)组、地塞米松(dexamethasone, DEX)治疗组和白藜芦醇(resveratrol, RES)治疗组。各组大鼠均于制模后3、6、12h采集标本。生化方法进行肝功能测定;酶联免疫吸附试验(enzyme linked

2、 immunosorbent assay, ELISA)测定血清TNF 和IL6含量;透射电镜观察胰腺和肝脏超微结构的变化;RTPCR检测凋亡调控基因Bax、Bcl2和caspase3 mRNA表达;Western Blot检测凋亡调控基因Bax、Bcl2、caspase3和线粒体内细胞色素C蛋白的表达。结果 SAP组各时间点血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)和总胆红素(total bilirubin, TBIL)水平均明显高于SO组(P 0.05)，RES组和DEX组肝功损

3、害较SAP组明显降低(P 0.05)。RES组和DEX组TNF 、IL6含量均明显低于SAP组(P 0.05)。SAP组出现明显细胞肿胀、毛细血管淤血、血栓形成、线粒体肿胀和细胞凋亡等超微结构的变化，RES组和DEX组上述改变明显减轻。RES组Bax、caspase3 mRNA表达显著低于SAP组(P 0.05)，Bcl2 mRNA表达明显高于SAP组。Western blot 检测结果与RTPCR结果一致。RES组各项指标与DEX组差异不显著(P 0.05)。结论 白藜芦醇可以降低SAP大鼠肝细胞凋亡的发生，从而起到减轻SAP介导的肝脏功能损伤的作用。 【关键词】 重症急性胰腺炎;白藜芦醇;

4、肝功能损害;Bax;Bcl2;caspase3;细胞色素C in rats with severe acute pancreatitisSHA Huanchen, MA Qingyong, JHA Rajiv Kumar, XU Fuguo, MA Zhenhua (Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian , China)ABSTRACT: Objective To demonstrate the pr

5、otective effect of resveratrol (RES) on the hepatic function in rats with severe acute pancreatitis (SAP). Methods Ninetysix male SpragueDawley (SD) rats were randomly divided into four groups: shamoperation (SO) group, SAP group, dexamethasonetreated (DEX) group and resveratroltreated (RES) group,

6、each group having 24 rats which were evaluated at 3, 6, and 12h during the experiment. Serum hepatic function was determined by biochemical detection. Serum TNF and IL6 levels were determined by ELISA. The ultrastructure of hepatic and pancreatic tissues was observed by transmission electron microsc

7、ope. The expressions of the apoptosisrelated genes and proteins Bcl2, Bax caspase3 and cytochrome C were observed using semiquantitative RTPCR and Western blot techniques respectively. Results The serum aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase and total bilirubin levels were significantl

8、y higher in SAP group than in SO group. The levels of AST, ALT and TBIL in RES group were lower than those in SAP group at all the time points (P 0.05), while there was no statistical significance between RES and DEX groups at any time points (P 0.05). The serum TNF and IL6 levels were higher in SAP

9、 group than in both RES group and DEX group (P 0.05). In SAP group, pancreatic and hepatic congestion, edema, inflammatory cell infiltration, mitochondrial swelling and cell apoptosis were apparent. In RES group and DEX group, pancreatic and hepatic morphological changes were alleviated at all theti

10、me points. In both RES and DEX groups, the mitochondrial membranous electric potential of hepatocytes was higher than in SAP group at any time point (P 0.05). In comparison with those in SAP group, the expressions of Bcl2 increased, whereas the expression of Bax, caspase3 and cytochrome c decreased

11、significantly in RES group (P 0.05). The results of Western blot and RTPCR were consistent, and no significant differences were found in all the indicators between RES group and DEX group. Conclusion Resveratrol could decrease hepatic cell apoptosis and improve hepatic injury in SAP rats. KEY WORDS:

12、 severe acute pancreatitis; resveratrol; hepatic injury; Bax; Bcl2; caspase3; cytochrome C 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一种常见的消化系统急腹症，具有发病急、病死率高等特点。导致患者早期死亡的主要原因为多器官动能不全(multiorgan dysfunction syndrome, MODS)和其继发的多器官功能衰竭(multipleorgan failure, MOF)。由于解剖位置、生理功能和血流动力学等因素，肝脏成为SAP时最易发生损害的胰腺外器官

13、之一。SAP患者肝脏功能损伤的发生率可高达80%100%不等1。而肝脏损害又反过来促进其他脏器的损害。肝脏作为机体代谢中心，其特殊和复杂的生理功能使之成为对急性胰腺炎病情进展影响最大的脏器。急性胰腺炎产生的炎性介质可以被肝脏降解灭活，同时也可以导致肝脏的损害，而肝脏损害可以通过直接或间接介导作用引起其他胰外脏器的损害。急性胰腺炎，尤其是SAP引起的肝脏损害机制复杂。近年来的研究发现，可能与胰酶激活、炎症介质、肝脏血流紊乱及肝脏细胞凋亡等因素密切相关。 我们前期大量的动物实验证实，白藜芦醇(resveratrol, RES)具有较好的治疗大鼠重症胰腺炎的作用26。本研究的目的是观察白藜芦醇对大鼠

14、肝脏损伤的保护作用以及其作用的可能通路，从而进一步探讨白藜芦醇治疗SAP的机制。 1 材料与方法 1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠96只，体重250300g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供;牛磺胆酸钠由美国Sigma公司提供;白藜芦醇由西安奥塞斯生物有限公司提供;TNF 、IL6 ELISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供;PCR试剂盒为日本TaKaRa生物技术公司产品;引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;Bax、Bcl2、caspase3、细胞色素C单克隆抗体，由美国Santa公司提供;辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗、小鼠抗 actin单克隆抗体，由北京博奥森生物技术公司提供

15、;线粒体提取试剂盒由美国Genmed生物工程有限公司提供;ECL增强化学发光剂由美国Pierce公司提供;透射电镜由日本东芝公司提供。 1.2 实验动物与模型制作方法 96只成年雄性健康SD大鼠，随机分为假手术组(SO)组、胰腺炎模型组(SAP)组、白藜芦醇治疗组(RES)和地塞米松对照(DEX)组，每组分为3、6、12h三个时间点各8只。大鼠禁食12h，禁水4h，25g/L戊巴比妥钠(1.2mg/kg)腹腔注射麻醉。动脉夹夹闭胰胆管近端和远端，40g/L牛磺胆酸钠(1mL/kg)经胰胆管逆行注射，保持1min后拔出穿刺针，取出动脉夹。SO组仅于开腹翻动十二指肠后缝合腹壁。RES组在建立模型后

16、立即经阴茎背静脉注射白藜芦醇10mg/kg。DEX对照组在建立模型后立即经阴茎背静脉注射地塞米松0.5mg/kg。大鼠分别在造模后3、6、12h剖杀取材。 1.3 大鼠12h腹水计量和死亡率记录 以10mL注射器收集大鼠腹水并计量。未到12h死亡的大鼠从本组中排除，另选大鼠补齐，以死亡的大鼠数量和总计应用的大鼠数量比值计算大鼠死亡率。 1.4 血浆ALT、AST和TBIL含量的检测 大鼠剖杀前从门静脉取血4mL，1500g离心2min收集血浆，部分标本-80保存用于ELISA检测，部分标本应用自动生化分析仪测定血浆中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草

17、转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)和总胆红素(total bilirubin, TBIL)水平。 1.5 血浆TNF 和IL6的ELISA检测 应用晶美生物工程有限公司提供的ELISA检测试剂盒检测血浆中TNF (tumor necrosis factoralpha)和IL6(interleukin6)的含量。详细步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。 1.6 肝组织和胰腺组织的病理学观察 胰腺组织40g/L多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，作HE染色，光镜下观察胰腺组织病理学改变。另取肝脏和胰腺组织1mm3以25mL/L戊二醛4固定8h，梯度酒精脱水，环氧树

18、脂Epon812浸透，LKBV型超薄切片机进行超薄切片(5070nm)，电镜下观察组织超微结构的改变。 1.7 肝组织总RNA提取及RTPCR 用Trizol试剂提取肠黏膜细胞中的总RNA，测定A260/A280的比值，计算RNA浓度。取RNA 2 L，用RT试剂盒合成cDNA链。用2 L cDNA作为模板，PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：变性94 30s，退火55 45s，延伸72 1min，共30个循环;72延伸10min终止反应。扩增产物用15g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统摄影。引物序列、退火温度及产物片段见表1。表1 引物序列、退火温度及产物片段 1.8 肝组织凋亡调控

19、蛋白的Western blot检测 肝组织蛋白和线粒体提取后，BCA 法测定蛋白含量，按每泳道加总蛋白50 g进行SDSPAGE凝胶电泳，湿转至硝酸纤维素滤膜，50g/L脱脂奶粉室温封闭2h，加入小鼠抗大鼠Bax、Bcl2、caspase3和细胞色素C(11000)一抗，4孵育过夜，吐温20磷酸盐缓冲液洗膜4次，每次15min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(16000)，ECL(enhanced chemiluminescene)增强化学发光系统显色20min，X光片曝光。 actin作为内参照，对上样一致性进行评估。采用GDS8000型凝胶成像分析系统进行半定量分析。 1.9 统计学处理 应

20、用SPSS13.0进行数据分析，组内比较用单因素方差分析，大鼠死亡率应用 2检验，结果用均数 标准差( s)表示，以P 0.05判定为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 大鼠12h腹水计量和死亡率 各组大鼠12h死亡率分别为SO组0(0/8)、SAP组50.0%(8/16)、RES组27.3%(3/11)、DEX组38.5%(5/13)。RES组和DEX组大鼠死亡率较SAP组死亡率明显降低(P 0.05)。RES组和DEX组腹水计量结果亦明显低于SAP组(P 0.05，表2)。 2.2 血浆ALT、AST和TBIL含量的测定 SAP组血浆ALT、AST和TBIL含量较SO组明显升高(P

21、0.05)。与SAP组比较，RES组和DEX组ALT、AST和TBIL含量明显降低(P 0.05，表2)。 2.3 血浆TNF 和IL6的ELISA检测 SAP组各时间点TNF 和IL6含量均明显高于SO组(P 0.05)，RES组和DEX组各时间点TNF 和IL6水平均低于SAP组(P 0.05)，RES组和DEX组之间无明显差异(表2)。 2.4 肝脏和胰腺组织病理学的改变 SO组无明显病理学改变。SAP组肉眼见胰腺片状坏死，胰周及网膜点状皂化斑，大量血性腹水;镜下胰腺实质坏死及炎性细胞浸润均较严重，提示SAP模型复制成功。RES和DEX组胰腺组织病理改变均较SAP组明显减轻。SAP组透射

22、电镜可见到典型细胞凋亡、线粒体肿胀、细胞水肿、毛细血管充血、血栓形成等病理改变。RES和DEX组上述变化明显减轻(图1)。表2 各组大鼠12h的肝功能状况与TNF 、IL6和腹水计量结果 2.5 肝组织Bax、Bcl2和caspase3 mRNA的表达 在SO组Bax、Bcl2和caspase3 mRNA的表达相对较低或不表达;SAP组Bcl2 mRNA表达水平稍有上升，Bax mRNA表达水平明显上升，RES组和DEX组Bcl2 mRNA表达水平明显上升，Bax和caspase3 mRNA表达水平明显下降(P 0.05，图2)。 2.6 肝组织Bax、Bcl2、caspase3和细胞色素C蛋

23、白的表达 SO组Bax、Bcl2、caspase3均呈较低水平表达，线粒体内细胞色素C呈高水平表达。SAP组各时间点Bax和caspase3表达明显高于SO组，Bcl2和细胞色素C蛋白表达明显低于SO组(P 0.05)。与SAP组相比，RES组和DEX组各时间点Bax和caspase3蛋白表达明显降低，Bcl2和细胞色素C蛋白表达明显升高(P 0.05，图3)。 3 讨 论 Rindernecht7认为过渡激活的炎症介质如TNF 、IL6等是SAP并发多器官功能损伤的关键因素。作为胰腺血液回流的第一站，肝脏是受来自胰腺激活的细胞因子攻击的首要靶器官。同时，受到刺激的肝脏本身又释放大量炎症介质。肝脏功能受损以后，不能及时有效清除来自肠道的内毒素，从而进一步刺激大量细胞因子和炎症介质的释放，形成所谓 瀑布样 连锁反应，最终诱发多器官功能损伤7。我们在成功建立大鼠SAP模型以后，随着血浆TNF 、IL6水平升高、细胞凋亡调控基因和相关蛋白表达上调，反映肝脏功能的ALT、AST和TBIL水平也相应升高，提示细胞凋亡的增加参与了SAP时肝功能损害的病理生理过程。 细胞凋亡发生机制复杂，多个基因参与细胞凋亡的调控，其中Bcl2家族就是一种重要的凋亡调控基因。根据Bcl2家族成员结构和功能的不同，可将其分为两大类：抑制凋亡的家族成员(包括Bcl2、Bclxl)等和