细菌的形态学检查法.ppt

1、细菌形态学检查法,显微镜的使用,显微镜的发明，使人看到了许多以前从未看到过的生物，如细菌、病毒等，也使人看到了生物的许多微小结构，如线粒体的结构，从而对生物学的发展起着重要的推动作用。显微镜是生物学研究的重要仪器之一。在医学、工农业生产中显微镜也有着重要用途，例如在医学诊断上，可对人血液中的红细胞进行计数等。,显微镜是人类各个时期最伟大的发明物之一。在它发明出来之前，人类关于周围世界的观念局限在用肉眼，或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。显微镜把一个全新的世界展现在人类的视野里。人们第一次看到了数以百计的“新的”微小动物和植物，以及从人体到植物纤维等各种东西的内部构造。显微镜还有助于科学家发现

2、新物种，有助于医生治疗疾病。上图：这是17世纪英国科学家罗伯特胡克的显微镜。它有一根内装透镜的简易皮管，安放在一个可调整的架子上。灌满水的玻璃球用来把光聚焦到物体上。最早的显微镜是16世纪末期在荷兰制造出来的。发明者可能是一个叫做札恰里亚斯詹森的荷兰眼镜商，或者另一位荷兰科学家汉斯利珀希，他们用两片透镜制作了简易的显微镜，但并没有用这些仪器做过任何重要的观察。后来有两个人开始在科学上使用显微镜。第一个是意大利科学家伽利略。他通过显微镜观察到一种昆虫后，第一次对它的复眼进行了描述。第二个是荷兰亚麻织品商人安东尼凡列文虎克（1632年-1723年），他自己学会了磨制透镜。他第一次描述了许多肉眼所看

3、不见的微小植物和动物。1931年，恩斯特鲁斯卡通过研制电子显微镜，使生物学发生了一场革命。这使得科学家能观察到像百万分之一毫米那样小的物体。1986年他被授予诺贝尔奖。,第一节光学显微镜的发展历史,早在公元前一世纪，人们就已发现球形透明物体可使物体放大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒通过实验研究出合理的显微镜光路结构。,1665年前后，英国的胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。16731677年期间，荷兰的列文胡克制成单组元放

4、大镜式的高倍显微镜。19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。,这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。,古典的光学显微镜只是光学元件和精密机械元件的组合，它以人眼作为接收

5、器来观察放大的像。后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图像信息采集和处理系统。,第二节显微镜原理,一、基本光学原理1.折射2.透镜的性能3.凸透镜的五种成象规律,折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角。,Definitions,AcceptanceangleN

6、umericalApertureNA=nsinRayleighresolutioncriterionforacircularaperturex=0.61/NA,Rayleighcriterionforresolution,;www.imb-jena.deS,NumericalAperature,Resolution,RayleighCriterion,透镜的性能透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学元件，物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依

7、其外形的不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称焦点，通过交点并垂直光轴的平面，称焦平面。焦点有两个，在物方空间的焦点，称物方焦点，该处的焦平面，称物方焦平面；反之，在象方空间的焦点，称象方焦点，该处的焦平面，称象方焦平面。光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成倒立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。,二、成象原理物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像。放大的实像位于目镜的物方焦点上，或者在很靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像后供眼睛观察

8、。虚像的位置取决于物方焦点和放大实像之间的距离，可以在无限远处，也可以在观察者的明视距离处。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。,OPTICALMICROSCOPES,Imageconstructionforasimplebiconvexlens,凸透镜的五种成象规律1.当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象；2.当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象；3.当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；4.

9、当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象；5.当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。,三、光学技术参数1.数值孔径数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsin2.分辨率显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称“鉴别率”。其计算公式是=/2NA3.总放大倍率单个物镜的放大倍率目镜的放大倍率4.焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得

10、清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。,5.视场直径观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。6.覆盖差显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。7.

11、工作距离WD,第三节照明方法,显微镜的照明方法按其照明光束的形成，可分为“透射式照明”，和“落射式照明”两大类。前者适用于透明或半透明的被检物体，绝大数生物显微镜属于此类照明法；后者则适用于非透明的被检物体，光源来自上方，又称“反射式照明”。主要应用与金相显微镜或荧光镜检法。,一、透射式照明1.临界照明光源经过聚光镜后，成像于物平面上,若忽略光能的损失，则光源像的亮度与光源本身相同，因此，这种方法相当于在物平面上放置光源。2.柯拉照明临界照明中物面光照度不均匀的缺点，在柯拉照明中可以消除。在光源与聚光镜之间加一辅助聚光镜。可见，由于不是直接利用光源，而是把光源均匀照明了的辅助聚光镜（也称为柯拉

12、镜）成像在标本上，所以物镜的视场（标本）得到均匀的照明。,二、落射式照明在观察不透明物体时，例如通过金相显微镜观察金属磨片，往往是采用从侧面或者从上面加以照明的方式。此时，被观察物体的表面上没有盖玻璃片，标本像的产生是靠进入物镜的反射或散射光线。,三、暗视场照明方法用暗视场方法可以观察超显微质点。所谓超显微质点，是指那些小于显微镜分辨极限的微小质点。暗视场照明的原理是：不使主要的照明光线进入物镜，能够进入物镜成像的只是由微粒所散射的光线。因此，在暗的背景上给出了亮的微粒的像，视场背景虽暗，但衬度（对比）很好，可以使分辨率提高。暗视场照明又有单向和双向之分。,第四节光学显微镜的组成结构,光学显微

13、镜包括光学系统和机械装置两大部分。,一、机械装置1.机架2.目镜筒3.物镜转换器4.载物台5.调焦机构6.聚光器调节机构,二、光学系统（一）目镜（二）物镜1.物镜的主要参数2.物镜的基本类型（三）光源（四）聚光器1.阿贝聚光镜2.消色差聚光镜3.摇出式聚光镜4.其它聚光镜,显微镜的构造概说,目镜镜筒旋转盘高倍物镜低倍物镜镜臂,固定夹载物台粗调节轮细调节轮反光镜(灯光)光圈镜座,目镜,放大倍率有10X/15X，可因应个人的双眼距离来调整,镜筒,介于接目镜与接物镜之间,旋转盘,接于镜筒下方，通常有三个接孔，可接不同倍数的接物镜，本身可以旋转藉以更换不同倍数的接物镜。,高倍物镜-低倍物镜,有不同倍数

14、在标本上方低倍镜放大倍数小，较短，视野亮。高倍镜放大倍数大，较长，视野暗。,镜臂,连接镜筒及镜座，可供握取显微镜。,固定夹,夹住标本避免滑落,载物台,为放置标本玻片的平台，中央有一圆孔，可供光线通过。,粗调节轮,位于镜臂两侧，可调节载物台的升降，以供对焦转动时镜筒升降的幅度大。,细调节轮,位于镜臂两侧，可调节载物台的升降，以供对焦转动时镜筒升降的幅度小。使用高倍物镜时的专用调节轮,反光镜,位于载物台下方中央，由凹面镜子组成，可使光线向上反射，经过载物台上的圆孔进入物镜和目镜，到达观察者的眼睛。但若阳光不强则需用灯光加强光源,光圈,接于反光镜上方，上有一支调整柄，可用以调整光圈孔径大小，以调整投

15、射于标本上之光线强弱。,镜座,显微镜之最底部。,不同显微镜物镜的特性比较光(450nm时可以达到的分辨率),三、数码摄像系统数码显微镜的组成结构与光学显微镜基本相同，不同处在于数码显微镜以摄像头作为接收元件，外带图像采集卡、软件并与微机联用。,第五节光学显微镜的分类,一、光学显微镜的分类方法按使用目镜的数目可分为双目、单目和多目显微镜；按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；按观察对像可分为生物和金相显微镜等；按光学原理可分为偏光、相差和微差干涉对比显微镜等；,按光学组件不同可分为明视场，暗视场，相差显微镜；按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可

16、分为目视、数码（摄像）显微镜等常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。,二、荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。荧光显微镜是用短波长的光线照射用荧光素标记过的被检物体，使之受激发后而产生荧光，然后观察。目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。,三、相差显微镜相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相差镜检法广泛应用于倒置显微镜

17、中。,PhaseContrast,UsefulforsampleslackingincontrastMakesuseofdifferencesinrefractiveindexbetweensampleandsolvent,四、倒置显微镜由于上述样品特点的限制，被检物体均放置在培养皿（或培养瓶）中，这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长，能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此，物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来，故称为“倒置显微镜”。倒置显微镜是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。,五、暗视场显微镜分辨率高,安装有

18、暗视野聚光器的物镜并配有强光光源。,六、数码显微镜数码显微镜是以摄像头（即电视摄像靶或电荷耦合器）作为接收元件的显微镜。在显微镜的实像面处装入摄像头取代人眼作为接收器，通过这种光电器件把光学图像转换成电信号的图像，然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜可以与计算机联用，这便于实现检测和信息处理的自动化，多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。,第六节显微镜的使用,【实验目的】通过本实验学会科学的使用显微镜，尤其对油镜的使用。【实验器材】明场显微镜、暗场显微镜、倒置显微镜、数码显微镜、细菌涂片、石蜡切片、培养细胞。,【操作步骤】（1）把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿67

19、cm左右。（2）接通电源，打开光源开关，转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔，把孔径光阑调至最大，调节光强到合适大小，使光线通过聚光器入射到镜筒内，这时视野内呈明亮的状态。,（3）放置样品于载物台上，使样品中要被观察的部分位于通光孔的正中央，然后用标本夹夹好。用10物镜聚焦，先转动粗调节旋钮，使载物台上升，物镜逐渐接近样品。然后注视目镜内，（要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯，以便在观察的同时能绘图），并转动细调节旋钮，使载物台慢慢下降，不久即可看到玻片中材料的放大物像。（4）调节双目镜筒的光瞳距离内退或外拉有刻度的滑板，使两眼都能看到样品，使左右两个视场象合二为一。,（5）屈光度

20、的调节调节屈光度是为了适应观察者的视力。最简单的方法是先调节右面目镜，同时用微调使标本聚焦，右眼看到清晰的图象。然后再用左眼观察，不动粗细调节旋钮，只转动左侧目镜的调节环，直至获得最清晰的图象。（6）如果在视野内看到的物像不符合实验要求，可慢慢调节载物台移动手柄。调节时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰，可以调节微动调焦手轮，直至物像清晰为止。,（7）如果进一步使用高倍物镜观察，先把物像中需要放大观察的部分移至视野中央，再转换高倍物镜，这时物像不很清晰，可以转动微动调焦手轮进行调节。（8）在转换高倍物镜并且看清物像之后，可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚

21、光器的高低，使光线符合要求（一般孔径光阑为视场光阑的60%80%）。（9）观察完毕，先将物镜镜头从通光孔处移开，然后将孔径光阑调至最大，再将载物台缓缓落下，并检查零件有无损伤（特别要注意检查物镜是否沾水沾油，如沾了水或油要用镜头纸擦净），检查处理完毕后即可装箱。,【注意事项】（1）必须熟练掌握并严格执行使用规程。（2）取送显微镜时一定要一手握住弯臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。取送显微镜时要轻拿轻放。（3）观察时，不能随便移动显微镜的位置。（4）凡是显微镜的光学部分，只能用特殊的擦镜头纸与溶液一同擦拭，不能乱用他物擦拭，更不能用手指触摸透镜，以免汗液玷污透镜。,（5

22、）保持显微镜的干燥、清洁，避免灰尘、水及化学试剂的玷污。（6）转换物镜镜头时，不要搬动物镜镜头，只能转动转换器。现在显微镜有电动转换,这点比较好,使用也很方便.是一个发展方向。（7）切勿随意转动调焦手轮。使用微动调焦旋钮时，用力要轻，转动要慢，转不动时不要硬转。,（8）不得任意拆卸显微镜上的零件，严禁随意拆卸物镜镜头，以免损伤转换器螺口，或螺口松动后使低高倍物镜转换时不齐焦。（9）使用高倍物镜时，勿用粗动调焦手轮调节焦距，以免移动距离过大，损伤物镜和玻片。（10）用完先关光源，后拔电源插头，这样对灯泡有保护作用。,Water,Air,Soil,Food,People,Animal,染色观察,普

23、通染色,特殊染色,单染法,复染法,革兰氏染色,抗酸染色,细菌的观察,不染色观察,压滴法,悬滴法,应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式常用方法：压滴法、悬滴法,一、不染色标本检查,实验一悬滴法和压滴法【实验目的】1.认识细菌的基本形态。2.学习并掌握细菌压滴片及悬滴片的制作方法。【实验材料】1.接种环、载玻片、盖玻片、凹槽玻片、凡士林、酒精灯、显微镜。2.大肠杆菌和金葡菌612h肉汤培养物。,【实验方法】1悬滴法标本制作,取2张洁净凹玻片，在凹窝四周涂少许凡士林。用接种环各取1环大肠杆菌，葡萄球菌培养物分别置于两片盖玻片中央。将凹玻片倒合于盖玻片上，使凹窝中央正对菌液。迅速翻转载玻片，用小镊子

24、轻压，使盖玻片与凹窝边缘粘紧封闭，以防水分蒸发。先用低倍镜拽到悬滴边缘，再换高倍镜，观察时应下降聚光器，缩小光圈，减少光亮，使背景较暗易于观察。,2压滴法标本制作,接种环取23环菌液置于洁净载玻片中央。用小镊子夹1块盖玻片轻轻覆盖在菌液上，放置盖玻片时应注意，将盖玻片的一端接触菌液，缓缓放下，避免产生气泡并防止菌悬液外溢。先用低倍镜观察，找到细菌所在部位后再换高倍镜观察，看细菌能否运动,【实验结果】大肠杆菌有鞭毛，运动活波，可向不同方向迅速运动，葡萄球菌无鞭毛，不能做真正运动，只能在一定范围内做位移不大的颤动，这就是布朗运动。注意：标本治好后应该尽快观察，以免水分蒸发影响观察结果。,二、染色标

25、本检查,微生物学中为什么必须采用染色方法？,物理因素细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用,ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesigInc.,化学因素根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应,基本原理,染色的基本程序,染色,固定,自然干燥,制片,干燥,水洗,复染,脱色,镜检,【实验目的】1、掌握单染色的操作技术2、观察细菌的基本形态【实验原理】单染色即用单纯的一种染料进行染色，一般细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色，故常用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此

26、法仅能显示细菌的大小、形态与排列，不能显示细菌的结构与染色特性。,实验二单染色细菌检查法,【材料与试剂】1.葡萄球菌和大肠杆菌1824h固体培养物2.美蓝和稀释石碳酸复红染液3.载玻片、酒精灯、接种环、染色架、滤纸等【方法】1.涂片在载玻片上滴一滴蒸馏水，用接种环挑取培养物少许，置载玻片的水滴中，与水混合做成悬液并涂成直径约1厘米的薄层，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。2.固定手执载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过34次，共约23秒钟，使水份蒸发，此时细菌菌体紧贴在玻片上。3.染色滴加染液（葡萄球菌滴美蓝，大肠杆菌滴石碳酸复,红染液）以覆盖涂抹的菌膜为度，不宜过多

27、，染色时间为12min。用细小的水流轻轻冲洗染色剂（注意不要直接冲洗染色部位），直至无多余的染液，滤纸从旁吸干。4.镜检首先在低倍镜下找到物像，然后在涂膜中央滴一滴香柏油，换成油浸镜观察两个菌种的形态和排列。【结果】葡萄球菌兰色葡萄状排列大肠杆菌红色散在排列注意：去除油镜上的香柏油：先用干净的擦镜纸擦2-3次，再换另一张擦镜纸蘸取少许二甲苯以除去残留的香柏油，最后用擦镜纸擦干。擦镜头时应顺着镜头直径方向擦，不要沿着圆周方向擦。,录像演示,【定义】用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。复染色一般要经过制片、固定、染色、脱色、复染、水洗、干燥和镜检八个步骤。,复染色法,实验三革兰氏染色法,【实验目的】了解革兰氏染色的原理，并掌握革兰氏染色法的操作技术。【实验原理】根据酒精脱色后结晶紫是否能在细菌上滞留，可以将细菌分为革兰氏染色阳性菌（G+）和革兰氏染色阴性菌（G-）。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。G+细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而G-细胞壁脂