《核酸的分离与检测》PPT课件.ppt

1、Chapter 3 Separate and investigate target gene,Wellcome to Genetic Engineering By Nieguangjun E-mail:,从哪儿提取（Where）？ 怎么提取（How）？ 提到什么程度（What）？ 会出现什么问题（Questions）？如何解决（Solution）？,核酸提取的原则和基本要求 核酸提取的一般过程 关键试剂的作用 核酸的部分特征 核酸提取的常用方法 核酸提取经典案例 核酸提取的注意事项 核酸提取出现的问题及对策 核酸提取的相关说明,主要内容,核酸提取的原则和基本要求,Principle and s

2、teps,Principle 保持核酸的完整性； 提高核酸的质量（纯度和浓度）。 Requirements for purification 不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其他事物大分子（Pr、sugar and lipid） 其他核酸污染,核酸提取的一般过程,Principle and steps,Steps 样品准备（取材） 破细胞（物理法、化学法、酶法）； 除杂质（蛋白质、脂类、糖类和不需要的核酸）； 沉淀提纯,I.材料准备 II.破碎细胞或包膜内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,破碎细胞-方法,机

3、械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS或CTAB处理细胞； 酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。,破碎细胞-来源,动物：小牛胸腺动物肝脏、血液和肌肉组织等鱼类精子； 植物：种子的胚中都含有丰富的DNA。 微生物：谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%（培养过夜）。,Note： 从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。 对于低等生物。如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 分子量较小，提取时易保持其结构完整性。 从高等动植物中提取DNA难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。,破碎细胞（来源-方法

4、）,微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,抽提核酸除去杂质,1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离 2使核酸与蛋白质分离 3除去脂类 4多糖的除去,How to remove ？,核酸的纯化,根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,How to do？,核酸样品的保存,核酸保存的主要条件是温度和介质 温度：

5、4（5）最佳和最简单 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0,关键试剂的作用,关键试剂的作用,核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,关键试剂的作用,核酸酶的抑制和抑制剂 RNase抑制

6、 操作要带手套。 所有器皿要严格消毒， 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。,关键试剂的作用,核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3对RNase、DNase有一定的抑制作用。,关键试剂的作用,核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNas

7、e活性和破裂细胞的作用。,如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,关键试剂的作用,核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶,核酸的部分特征,核酸的部分特征,存在形式 pH值影响 盐影响 温度影响,1.存在形式,RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA

8、及无机离子等，从中分离DNA 。, removal of Pr,2.pH值的影响,DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 在pH值高达12.6的碱性条件下，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA两条互补链不会完全分离，当以pH 4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA完全复性，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,碱变性法（for plasmid DNA）,3.盐影响,DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，

9、至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。,浓盐法,4.温度影响,高温变性 低温复性,沸水浴法（for plasmid DNA）,核酸的常用提取方法,常用的DNA提取方法,浓盐法 阴离子去污剂法 苯酚抽提法 水抽提法 沸水浴法 碱变性法,1. 浓盐法,原理： 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离； 常用的方法：用1M 氯化钠提取氯化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白

10、质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来（ 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白）。,1. 浓盐法,注意 以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。 在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用0.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.,2. 阴离子去污剂法,用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生

11、物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.,3. 苯酚抽提法,苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。 用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相。 利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。,4. 水抽提法,利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞

12、破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液； 在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出； 然后分别用66% 80%和95%乙醇以及丙酮洗涤； 最后在空气中干燥,既得DNA样品。,此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。,5. 沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）,1. 在Eppendorf管中加入110 ml的STET（使用前加入溶菌酶至终浓度为5 mg/ml）（蔗糖8，Triton X-1005，Tris-HCl (pH8.0) 50 mM， EDTA (pH8.0) 50 mM）溶液，挑入米粒大小的菌

13、团，充分悬浮并混匀。 2. 上述菌体悬浮液沸水煮30秒。 3. 迅速放置于常温下15000 rpm离心15分钟。,5. 沸水浴法（提取大肠杆菌质粒DNA）,4. 用牙签挑去菌体碎片（白色沉淀），在上清液中加入100 ml的异丙醇，充分混匀后4，15000 rpm离心20分钟。 5. 弃上清液，加入70%冰乙醇400 ml，4，15000 rpm离心5分钟。 6. 沉淀凉干后用50 ml无菌重蒸水溶解。 7. 取5 ml电泳检测。,6. 碱变性法,原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 在高pH值条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而

14、变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离； 当pH值调至至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,核酸提取的经典案例,主要案例,碱变性法制备大肠杆菌质粒DNA 大肠杆菌染色体DNA的抽提 CTAB法提取植物基因组DNA,6. 碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA）,1. 1.5 ml培养物6000 rpm，4离心10分钟，弃去上清液。 2. 加入100 ml溶液I悬浮菌体，室温放置5分钟。 3. 加入200 m

15、l溶液II，立即轻轻混匀，室温放置至溶液几乎澄清。 4. 加入150 ml溶液III，轻轻混匀，冰浴30分钟。 5. 4，15000 rpm离心20分钟，收集上清液。 6. 上清液中加入等体积的苯酚饱和溶液（400 ml）氯仿，充分混匀，4，15000 rpm离心20分钟，将上清液转移至另一离心管。,6. 碱变性法（制备大肠杆菌质粒DNA）,7. 在上清液中加入400 ml氯仿溶液，混匀，10000 rpm离心10分钟，将上清液转移至另一离心管。 8. 在上清液中加入400 ml异丙醇，20放置30分钟，4，15000 rpm离心20分钟。 9. 用400 ml 75%的冰乙醇洗涤一次，凉干。

16、 10. 加入50 ml无菌重蒸水溶解质粒DNA。 11. 取2 ml作酶切电泳检查。,6. 碱变性法-试剂,溶液I：D-Glucose 50 mmol/L，Tris-Hcl（pH 8.0）50mmol/L，EDTA（pH 8.0） 10mmol/L 121消毒20分钟，使用时加入溶菌酶，终浓为 5mg/ml 溶液II：SDS1% NaOH0.2 mol/L 溶液III：KAc（pH5.5） 3 mol/L,溶液-溶菌液,1溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。（保持碱性和较低的离子强度环境

17、） 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。,溶液-溶菌液,2.EDTA的作用：（1）螯合Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。 （2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。,溶液-NaOH-SDS液,NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液中的NaOH浓度为0.2mol/L,加抽提液时，该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性.,溶液-NaOH-SDS液,SDS

18、：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有： （1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 （2）解聚细胞中的核蛋白。 （3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。,溶液-3MOL/LNaAc(pH4.8)溶液,NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了将pH12.6的抽提液调回pH至中性,使变性的质粒D

19、NA能够复性,并能稳定存在。而高盐的3Mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA, RNA,以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。,大肠杆菌染色体DNA的抽提,大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时，6000rpm，4，离心10分钟收获菌体沉淀。 沉淀中加入3.6 ml Buffer A（含溶菌酶5 mg/ml），旋涡振荡混匀，37保温30分钟。 加入400 ml 10% SDS使最终浓度为1%，混匀，37保温30分钟或澄清即可。 加

20、入10 ml 20 mg/ml的ProK至最终浓度为1 mg/ml，60保温60分钟。 加入1 ml预先冷冻的5 mol/L NaCl至最终浓度为1 mol/L，充分混匀后冰浴30分钟。 4，15 000 rpm，离心30min。,大肠杆菌染色体DNA的抽提,取上清加入等体积（5 ml）的苯酚饱和溶液，充分混匀后4，15000 rpm，离心30分钟。 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000 rpm，4，离心10分钟。 取上清加入0.8 V（4 ml）异丙醇充分混匀后 -20放置30分钟以上，4，15000 rpm，离心30分钟。 弃上清，沉淀用3ml 70%的冰乙醇洗涤，4，15000 r

21、pm，离心5分钟。 弃上清，沉淀于37凉干后，用1 ml ddH2O 溶解并移入Eppendorf管中。 取5 ml电泳。,CTAB法提取植物基因组DNA,CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。 最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。,实验程序,1.在2mL离心管中，加入500l的2CTAB和20 l-巯基乙醇, 65预热。2嫩的组织材

22、料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。,实验程序,3加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。4向管中加入1/100体积的RNase A溶液，置3720-30min。5加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20放置30 m

23、in或-80放置10min，12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。6 用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O中。7 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。,核酸提取的注意事项,注意事项,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,注意事项（细胞破碎）,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K

24、细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡,注意事项（分离与纯化）,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,注意事项（沉淀、溶解）,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn

25、2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,核酸提取的常见问题与对策,常见问题与对策,问题与对策,问题与对策,核酸提取的相关说明,为什么用无水乙醇沉淀DNA? 在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么加NaAC或NaCL? 加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再用SDS与KAc来处理? 为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？ 如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA? 抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好? 为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇? 为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?,为什么用无

26、水乙醇沉淀DNA?,乙醇的优点：可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。原理：DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。,在用无水乙醇沉淀DNA时，为什么要加NaAC或NaCL,在pH为8左右的DNA溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAC或NaCL,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果

27、也不好.在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀.,加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?,加进去的Rnase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好的效果。,为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？,在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰

28、作用。 在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性.,如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?,采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同,PEG的浓度低,选择性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的浓度只需1%左右,小分子所需PEG浓度高达20%. 选择性沉淀4.3Kb的pBR322质粒D

29、NA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最终PEG浓度为12%.PEG选择性沉淀DNA的分辩率大约100bp.,抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?,苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与水相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的痕量酚。（酚易溶于氯仿中） 经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。,

30、在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%-15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合(1:1)使用。 （利用氯仿除酚）,为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戌醇?,在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。 加入异戌醇能降低

31、分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。 一般采用氯仿与异戌醇为24:1之比。也可以采用酚,氯仿与异戌醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互异戌醇即成,)，同时异戌醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。,为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?,因为酚与水有一定的互溶。苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中,不致吸收样品中含有DNA的水分,减少DNA的损失。 用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定.在中性或碱性条件下(pH5-7),RNA比DNA更

32、容易游离到水相,所以可获得RNA含量较少的DNA样品。 保存在冰箱中的酚,容易被空气氧化而变成粉红色的,这样的酚容易降解DNA,一般不可以使用。,1. 传统的分离方法是用oligo (dT)-纤维素柱分离mRNA,2. 把oligo(dT) -磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA,3.用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA,三种分离mRNA的方法,用纤维素纯化poly(A)mRNA的流程图,Chapter 3-2 How to assay NA,Wellcome to Genetic Engineering By Nieguangjun E-mail:,Method

33、s,分光光度法 二苯胺法 定磷法 电泳检测法,分光光度法,原理：构成核酸的嘌呤和嘧啶环的共轭双键系统使核酸在260nm波长处有最大吸收峰，其光密度值与单位体积核酸含量成正比。 方法：核酸种类及其存在状态不同，其光密度值与核酸含量的比值有异， 浓度计算：1 OD 260相当于dsDNA 50g/mL，ssDNA33g/mL和ssRNA 40g/mL。 纯度计算：从OD260：OD280的值可定性DNA 并了解核酸的纯度，纯的DNA(RNA)制品的比值为1.8(2)。,二苯胺法测定DNA含量,DNA分子中2-脱氧核糖残基在酸性溶液中加热降解，产生2-脱氧核糖并形成-羟基-酮基戊酸，后者与二苯胺试剂

34、反应产生蓝色化合物，其反应如下图。 蓝色化合物在595nm处有最大吸收，且DNA在40g-400g范围内时，吸光度与DNA浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。,定磷法测定DNA,核酸经浓硫酸或高氯酸高温水解后，释放出无机磷。在酸性条件下，磷酸与钼酸铵结合，生成磷钼酸铵黄色沉淀： PO43-+3NH4+12MoO4 +24H+=（NH4）3PO412MoO36H2O +6H2O,在过量（NH4）212MoO4存在时，黄色沉淀溶解于过量的磷钼酸盐溶液中。当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再与试剂中其他的MoO42-结合成Mo（MoO4）2或Mo3O8，呈蓝色。

35、该产物在660nm处有最大的光密度峰，其峰值与光密度成正比。求得单位体积的含磷量除以9.0%既可得单位体积RNA的量，或除以9.2%则为DNA的含量（测DNA时）。核酸制品中微量的无机磷，非核酸的有机磷、硅酸盐、铁离子以及酸度过高或偏低都会影响定磷法的测定结果；但其灵敏度高，最低可测到核酸10g/ml的水平，准确性较好。,定磷法测定DNA,电泳检测法,原理：琼脂糖是一种直链多糖。它是由BD 吡喃半乳糖和3，6脱水半乳糖以1，3糖苷键相连的双糖聚合物，链状琼脂糖分子之间相互以氢键交联。形成网络系统。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，也不会引起核酸分子的变性，而且不吸附被分离的物质，因此成为基

36、因工程上首选的凝胶剂。当核酸分子在琼脂糖凝胶电场中时，分子上带电基团在pH8.0 条件下带负电荷，在电场作用中移向正数，至使核酸分子在琼脂糖凝胶电泳中有其迁移率。,迁移率与下列因素有关：,电泳检测法,电泳检测法,1.核酸分子的大小：在相同的条件下，不同大小的核酸分子的迁移率不同，小分子的迁移率大，大分子的迁移率小。其中线状双链DNA 分子在一定浓度琼脂糖上电泳的速度与线状双链DNA 分子的分子量对数成反比（图31）；所以根据迁移率大小可测定DNA 分子的大小。不过实际应用时，通常将待测定的DNA 和已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可知该样品的分子量大小。2、迁移率

37、与核酸构象有关,琼脂糖凝胶电泳可以鉴别分子量相同但构型不同的DNA 分子。在依常规方法抽提的质粒DNA 通常具有三种不同的构象:超螺旋型（SC）、线形（L）和开环型（OC）。这三种构型分子有不同的迁移率。在一般情况下,超螺旋型（SC）迁移速度最快，其次为线状（L）分子,最慢的为开环型（OC）分子。若提取到的质粒DNA 样品中,还有染色体DNA或RNA,在琼脂糖凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带,由此可分析样品的纯度(图32)。,凝胶电泳，DNA移动距离和分子量关系（缓冲液0.5TBE,0.5ug/ml 溴化乙锭电泳条件1v/cm 16小时）,提纯和未提纯质粒DNA电泳图,迁移率与电泳条件的关系

38、,低电压时，线状DNA片段的迁移速度与电压成正比，当电压高时，大分子量DNA片段的迁移速度就不再与电压成正比，所以电压一般不超过每厘米5伏。电泳液采用缓冲液，以保证较稳定的pH 值。pH 值的剧烈变化会影响DNA 分子所带的电荷，因而影响正常的电泳速度。电泳温度一般不影响电泳，但若因电压过高，引起发热将会导致胶融解。所以可采用冷却循环系统。,迁移率与琼脂糖浓度的关系,浓度越大，迁移率越低，当样品的分子量较大时，宜用较稀的琼脂糖浓度，分子量小时，浓度可选用大些，通常可选用0.7%浓度的凝胶。此浓度下分离DNA分子的范围为0.810 Kb。当核酸样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入在紫外线照射下能发射荧光的溴化乙锭（EB），EB就插入DNA分子中，形成荧光络合物，使其发射荧光增强几十倍，这样极其微量的DNA也可观察到。例如用肉眼观察，可检测