药品微生物限度检查法.ppt

1、药品微生物限度检查法，长春，吉林食品药品检验所，2008年3月29日，2020年8月11日，微生物限度检查法用于检查非处方无菌制剂及其原辅料的微生物污染程度，也是评价药品原辅料、设备、用具、工艺流程、环境和生产企业操作人员健康状况的重要手段和依据。检验项目包括细菌污染和细菌控制检验。2020/8/11/3，起草微生物限度检查法的指导思想，这也是目前世界上常用的方法。它基于琼脂平板上由细菌、霉菌或酵母形成的独立可见菌落。该方法的结果仅反映了在特定条件下生长的细菌、霉菌和酵母的菌落数。增加了测试的可操作性，使方法更加科学，保证了测试结果的准确性。2020/8/11/4，整个检验过程应严格遵守无菌操

2、作，并在环境洁净度为10000、局部洁净度为100的单向空气区进行，以防止二次污染。根据制药行业洁净室(区)悬浮颗粒、浮游菌和沉降菌的检测方法(GB/T 1629216294-1996)，应定期在单向空气区、工作台面和环境中进行洁净度验证。操作环境、2020/8/11/5、清洁度等级、2020/8/11/6、检验数量，即一次检验中使用的检验产品的数量(g、ml或cm2)，一般应随机选择，检验产品的数量应不少于检验数量的3倍(至少两个以上的包装单位)。除非另有规定，试验产品的试验量一般为10g或10ml；中药薄膜为50cm2的贵重药品，可适当减少微包装药品的检验数量。2020年8月11日要求沙门

3、氏菌的检测量增加10克或10毫升。供试品溶液的制备根据供试品溶液的理化特性和生物学特性，应采用适当的方法制备供试品溶液。如果测试溶液的制备需要水浴加热，温度不应超过45。从制备到加入培养基进行检验，试验溶液不得超过1小时。除非另有说明，测试样品的常用制备方法如下：2020/8/11，8，(1)取10毫升测试样品，加入稀释剂至100毫升，混合均匀，作为1:10测试溶液。水溶性液体制剂可与混合的供试品溶液一起直接用作供试品溶液。(2)取10克固体、半固体或粘性试样，加入稀释剂至100毫升，用均质机或其他合适的方法混合均匀，作为1:10供试品溶液。制备供试品溶液，2020/8/11/9，取5g(5m

4、l)水不溶性供试品溶液，放入装有司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g和聚山梨酯80 10g(温度低于45)的无菌溶解混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成球，然后向100ml中缓慢加入约45%的稀释剂，边搅拌边加入，使供试品溶液充分乳化。特殊试验溶液的制备方法，2020年8月11日，特殊试验溶液的制备方法，取10克试验溶液，放入装有玻璃珠和20毫升无菌肉豆蔻酸异丙酯的容器中，充分摇匀使试验溶液溶解，然后加入约45%的稀释剂，摇匀5-10分钟，提取至油水明显分层，取其水层作为133600肉豆蔻酸异丙酯的灭菌方法：采用膜过滤灭菌，使用孔径为0.22微米的脂溶性滤膜，2020/8/11/11，特殊测试溶液

5、的制备方法取50cm2水不溶性膜剂，切成片，加入适量稀释剂(通常为1 cm2/1ml或2ml)，浸泡，摇匀，作为1:10或1336020测试溶液使用。2020/8/11/12，特殊供试品溶液的制备方法，取10克肠溶和结肠溶制剂供试品溶液，加入100毫升pH 6.8的磷酸盐缓冲液(肠溶制剂)或pH7.6的磷酸盐缓冲液(结肠制剂)，置于45水浴中，摇匀使其溶解，作为1336010供试品溶液。2020/8/11/13，特殊测试溶液的制备方法，当测试产品具有抗菌活性时，应该是elimina常用的方法有：培养基稀释法、离心沉淀法、3000 rpm/分离中心20分钟、膜过滤法5分钟、2020/8/11/1

6、4、菌数报告规则、菌数、酵母平均菌落数在30-300之间、霉菌平均菌落数在30-100之间。当只有稀释等级的菌落数满足上述要求时，应通过将该等级的平均菌落数乘以稀释倍数来报告细菌数。2020/8/11/15，细菌数量报告规则。当两个稀释阶段的菌落数满足上述要求时，取决于它们的比值(比值是高稀释阶段的菌落数乘以稀释倍数除以低稀释阶段的菌落数乘以稀释倍数)。如果比值不大于2，将两个稀释等级的菌落数乘以稀释倍数的平均数，以报告细菌数；如果比值大于2但不大于5，通过将低稀释度菌落数乘以稀释倍数来报告细菌数。当比值大于5或高稀释度的菌落数大于或等于低稀释度的菌落数时，有必要找出原因并再次检查，如有必要，

7、重新验证该方法。2020/8/11/16，细菌数报告规则，当每个稀释等级中的平均菌落数小于30时，最低稀释等级中的平均菌落数乘以稀释倍数。在每个稀释等级的平板上没有菌落生长，或者只有最低稀释等级的平板有菌落生长，但是平均菌落数小于1，并且细菌数被报告为最低稀释倍数的1倍。2020/8/11/17，细菌数量的报告规则，每，2020/8/11/18，操作点，细菌、霉菌或酵母的菌落可由一种或多种细菌细胞的生长和繁殖形成，因此在测试样品中测量的菌落数量实际上是测试样品的整个菌落形成单位(cfu)灭菌培养基、稀释剂、实验仪器等。应按照灭菌方法的要求(见附录)进行，并应按照经过验证的灭菌程序进行。2020

8、/8/11/19，操作点，稀释试样时，应在每个稀释阶段更换吸管。细菌培养48小时，真菌培养72小时，计数。如果菌落很小且难以识别，可以适当延长培养时间。再次计算菌落的数量。对于含蜂蜜和蜂王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸提蛋白胨葡萄糖琼脂培养基测定发酵菌数，合并计数。如果两个平板在相同稀释度下的平均菌落数不小于15，则两个平板的菌落数之差不能大于1倍。使用无菌吸管时，管子的顶端不应接触任何可能被污染的容器或器具。稀释供试品溶液并注入皿中时，摇动后取均匀的供试品溶液，以免造成实验误差。2020/8/11/20，操作点，培养基的分装量不应超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装

9、时，必须将塞子塞紧，以免松动或脱落造成细菌污染。培养基应在制备后2小时内灭菌，以避免细菌繁殖。无菌培养基应保持在2-25，以防止污染，并可在三周内用完。溶解后的培养基应用完一次，打开后一般不应重复使用，培养基反复加热溶解时应保持在451。当温度高于45时，容易造成细菌损伤或死亡；当温度低于45时，容易凝固，影响混合。因此，使用前最好用水浴来保暖。将培养基倒入平皿并与样品一起均匀摇动时，不要溅到平皿的边缘和盖子上，以免影响实验结果。2020/8/11/21，操作要点，当采用膜过滤方法时，在过滤水溶性测试溶液以润湿膜之前，应过滤少量洗涤液。油样的滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为了充分发挥膜的最大

10、过滤效率，应注意，2020/8/11/22，操作要点：从每个滤膜上取相当于1克或1毫升供试品的供试品溶液，直接过滤或加入适量稀释剂，混匀，然后用适当的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数法验证”，冲洗后取出滤膜，贴在营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸粉蛋白胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少要准备一个滤膜，滤膜贴在平板上时不能有缝隙或气泡，否则会影响微生物的生长。2020/8/11/23，操作点，当菌落数小于100时根据实际数据报告。当菌落数大于100时，取两位有效数字进行报告，第三位数字按数字归约规则处理。2020/8/11/24，异常情况处理，菌落扩散：培养物中一些菌落

11、的扩散生长影响其他菌落的生长，甚至掩盖其他菌落并干扰计数。原因：原动力和培养环境湿度过大，为原动力菌创造了游动条件，促使形成扩散菌落的机会增加。2020/8/11/25，加入TTC:在倒入培养基之前，每1000毫升营养琼脂中加入1毫升灭菌的1%TTC溶液，混合均匀，倒入盘中。打开盖子晾干：打开凝固的琼脂平板，将其倒置在净化工作台上，启动1-2小时后关闭盖子，然后将其放入培养箱中。预防方法，2020年8月26日，预防方法，更换瓷砖盖：最近用干热灭菌的瓷砖盖更换固化琼脂板盖。2020/8/11/27，异常菌数报告，在特殊情况下，当生长在营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌的数量大于玫瑰红色钠琼脂培养基上

12、的数量时，报告为营养琼脂平板上的霉菌和酵母菌的数量；否则，如果生长在玫瑰红钠琼脂平板上的细菌数量大于营养琼脂平板上的细菌数量，则报告为玫瑰红钠琼脂平板上的细菌数量，2020/8/11。大肠杆菌试验程序：试验产品的试验溶液不少于100毫升胆盐乳糖富集液35371824小时。取0.2毫升5 ml MUG培养基，在35375、24小时和366 nm紫外光下观察，加入靛蓝基质试剂MUG为阳性，靛蓝基质阳性MUG为阴性，靛蓝基质阳性MUG为阴性，靛蓝基质阴性MUG为阳性。 取靛蓝基质阴性的胆盐乳糖培养基的跨线报告，曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板的3611824小时阳性和阴性显微镜检查，适当的生化试验

13、报告，2020/8/11/29，大肠杆菌试验程序，试验产品的试验溶液不少于100毫升胆盐乳糖富集溶液35371824小时。 取0.2毫升5mlMUG培养基，在35375、24小时和366纳米紫外光下观察，靛蓝基质试剂MUG为阳性，靛蓝基质阳性MUG为阴性，靛蓝基质阳性MUG为阴性，靛蓝基质阴性MUG为阳性，取靛蓝基质阴性的胆盐乳糖培养基的划线报告，曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板的3611824小时阳性和阴性镜检报告，适当的生化试验报告，2020年8月11日，30。注意事项，制备MUG培养基时，必须校正酸碱度。灭菌后，酸碱度不应超过7.4，否则，酸碱度将过高，而金属杯分解本身将显示荧光。将试

14、样的培养液接种在MUG培养基中，培养时间一般为4h和24h，观察是否产生荧光。如果荧光较弱且不能准确判断，培养时间可延长至48小时，然后观察结果。由于大肠杆菌菌株之间的GUD活性不完全相同，对底物和底物浓度的反应也不同；培养基中选择因素的影响；培养时间和温度；酸碱度的变化；大量竞争细菌的干扰和样品本身的物质组成也影响对结果的判断。2020/8/11/31，注意事项：观察MUG管时，可在366nm紫外灯下同时观察阳性对照管和阴性对照管。对于生长在曙红亚甲蓝琼脂或麦克隆上的可疑菌落在IMViC试验中，用无菌接种环挑取菌苔，先接种在柠檬酸盐琼脂斜面上，再接种在其他培养基如蛋白胨水上，以避免假阳性结果

15、。2020/8/11/32，大肠杆菌，80多年来，大肠杆菌一直被用作水中粪便污染的指示菌。大肠菌群定义：指37株生长时能发酵乳糖并在24小时内产生酸和气体的革兰氏阴性杆菌。除大肠杆菌外，符合上述定义的细菌还包括肠杆菌科肠杆菌、柠檬酸杆菌、克雷伯氏菌等。事实上，它基本上包括人和正常家畜肠道中所有需氧革兰氏阴性杆菌，比大肠杆菌更具代表性，存活时间更长。因此，检测到大肠杆菌，一般认为该药物最近被粪便污染；大肠杆菌的检测表明该药物在不久的将来或长期内会被粪便污染。以大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌具有广泛的卫生学意义，能更好地反映药品的卫生质量。2020/8/11/33，操作方法：取三个乳糖胆盐发酵管，分别加入1毫升1:10试液(0.1克或0.1毫升)、1毫升13360100试液(0.001克或0.001毫升)和0.01毫升1:1000试液(2020/8/11/34)，结果表明如果乳糖胆盐发酵管无菌生长产酸产气时，应进行确认试验，产酸产气发酵管应交叉接种在EMB或麦康凯琼脂平板上18-24小时。如果平板上没有菌落生长，可以判断在试管中没有检测到大肠菌群。如果平板上生长的菌落与药典