人胎盘源间充质干细胞成骨分化过程中免疫原性上调的研究-免疫学

人胎盘源间充质干细胞成骨分化过程中免疫原性上调的研究 摘 要摘 要目的：探讨间充质干细胞（MSCs）在成骨分化过程中的免疫原性改变及其分子机制。方法：用酶消化法获得人胎盘源间充质干细胞（PMSCs） ，并对其进行鉴定后，分别在体外和体内条件下，诱导其成骨分化。体内外成骨诱导 7 天后用流式细胞术（FCA）分别检测细胞表面协同刺激分子的表达情况；同时用成骨诱导后的细胞分别与 T 细胞共培养， 3H-TdR 掺入法或 CCK8 方法检测 T 细胞的增殖。利用茜素红染色、ALP 活性检测、micro-CT 、H&E 染色等方法检测 MSCs 体内外成骨效应，分析成骨效应。结果：1）成功分离培养 PMSCs ；2）体内外实验均显示 PMSCs 成功向成骨细胞分化，未分化的 PMSCs 不表达 CD28、CD80、CD83 、CD86、B7DC 等正性共刺激分子，但经成骨诱导分化后其表达上调；并且成骨诱导分化后的 PMSCs促进了 T 细胞增殖，而未诱导分化的 PMSCs 则未能促进；3）PMSCs 在体内成骨分化后 CD28、CD80、CD83、CD86、B7DC 等正性共刺激分子上调程度较PMSCs 在体外成骨更高。结论：未分化的 PMSCs 具有低免疫原性，但是在经成骨诱导分化后其免疫原性上调；PMSCs 在体内成骨分化过程中，免疫原性上调程度较体外成骨分化高。这对于间充质干细胞今后在临床的应用有很好的参考价值。关键词：胎盘源间充质干细胞；成骨诱导；协同刺激分子；T 细胞增殖Abstract Study on upreguleted immunogenicity of human placenta-derived mesenchymal stem cells during osteogenesisStudy on upreguleted immunogenicity of human placenta-derived mesenchymal stem cells during osteogenesis AbstractObjective To investigate the alteration of mesenchymal stem cells immunogenicity and involved molecular mechanisms during osteogenesis. Methods Human placenta-drived mesenchymal stem cells(PMSCs) were isolated from human placenta by trypsin-digesting. After being confirmed by flowcytometer (FCM) and chondro- and adipogenic differentiation they were induced to osteoblastes in vivo and vitro respectively. The costimulatory molecules were detected by FCMbefore and after PMSCs were induced in osteogenic medium for 7 days in vitro. Meanwhile, the expressions of costimulatory molecules were also detected by FCM at 7 days after PMSCs were implanted for osteogenic differentiation in vivo. 3H-TdR or Cell count kit (CCK8) were used to detect the proliferation of T cells cocultured with the PMSCs and PMSC-derived osteoblats that induced in vivo and vitro, respectively. Osteogenesis was confirmed by alkaline phosphatase (ALP) activity assay, alizarin red staining and H&E staining. Results 1) The PMSCs were prepared successfully. 2) The results showed that PMSCs can differentiate into osteoblasts well both in vitro and in vivo. The induced cells upregulated the expressions of positive costimulatory molecules including CD28, CD80, CD83, CD86, B7DC and so on, and they also promoted T cell proliferation. PMSCs are immuno-privileged in vitro. But their immunogenicity could be upregulated during osteogenic defferentiation. 3) There was higher expression of the costimulatory molecules in osteogenic-induced PMSCs in vivo than in vitro. Discussion PMSCs are immuno-privileged in vitro. But their immunogenicity could be upregulated during osteogenic defferentiation. The immunogenicity of the Study on upreguleted immunogenicity of human placenta-derived mesenchymal stem cells during osteogenesis Abstractinduced-PMSCs in vivo was higher than that induced in vitro. This should be fully considered when MSCs are applied in clinic.Key words：placenta-derived mesenchymal stem cells； osteogenesis；costimulatory molecules；T cell proliferation目 录前 言 .1第一部分 人胎盘间充质干细胞的分离与鉴定 .7材料和方法 .7结 果 .9结 论 .11第二部分 PMSCs 在体外诱导分化成骨过程中免疫原性的变化 .13材料和方法 .13结 果 .15结 论 .18第三部分 PMSCs 在体内诱导分化成骨过程中免疫原性的变化 .21材料和方法 .21结 果 .23结 论 .26讨 论 .27总结和展望 .32综 述 .33硕士研究生期间完成的论文 .45中英文对照缩略词表 .46致 谢 .47人胎盘源间充质干细胞成骨分化过程中免疫原性上调的研究 前 言1前 言在骨科临床上，骨不连和骨缺损等的治疗是经常面临的难题，据统计，我国每年因各种原因造成的骨缺损病人超过100万，骨移植在临床是仅次于输血的同种异体组织移植 1。造成骨损伤的原因是多方面的，如创伤、肿瘤、退化性病变、骨质丢失等 2,3，由于骨的特殊结构组织，生物学和生物力学特点，目前的治疗手段并不足以恢复损伤部位原有的结构和功能，大范围骨缺损的修复目前仍是十分棘手的问题。目前在我国和其他大部分国家和地区，自体骨仍是植骨材料的“金标准”，但是由于骨来源非常有限，可能难以满足大段骨损伤的修复，而且取骨后可能会造成取骨区的各种并发症，从而给患者带来额外痛苦；同种异体骨移植虽然相对较易获得材料，但是其效果远远不如自体骨移植，且存在疾病传播的问题 4；异种骨移植虽然在成本、来源等方面都有优势，但是潜在的动物疾病可能带来更大的风险 5。现在，间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在组织工程学的应用为解决这些问题提供了新的曙光。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中发现为非造血组织干细胞，由于其具有可分化为间充质组织细胞的能力，故称之为间充质干细胞 6。目前在几乎所有组织中都可以分离得到，包括脂肪、骨、心脏、脑、外周血、胎盘、脐血、羊水等 7-11。MSCs具有强大的自我更新能力，这一特性使其在相当长的时间内能产生与自身完全相同的细胞，有时甚至是在组织或器官的整个生命期。MSCs极易分化为软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞 12，此外 MSCs还可分化为肌肉、韧带、胰岛、心肌、神经元细胞等其他组织细胞 13-16。在连续传代培养和冷冻保存后，MSCs仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变等引起的组织器官损伤修复。具有独特的低免疫原性和免疫调节功能是MSCs最大的特点也是其最主要优点之一，据研究，MSCs可通过调控树突状细胞（DCs） 、NK细胞、T 、B细胞功能和旁分泌方式等多种途径抑制免疫应答 17-19。因此，在器官、组织损伤后的修复及自身免疫性疾病的治疗中，MSCs成为理想的异基因首选，并在多种疾病的治疗中得到证实：如它能治疗扩张型心肌病 20；联合基因治疗修复关节软骨损伤 21，22 ；抑制矽肺前 言 人胎盘源间充质干细胞成骨分化过程中免疫原性上调的研究2小鼠肺炎和肺的纤维化 23,24；促进脐血抑制术后血细胞功能的重建 25；抑制移植物抗宿主病(GVHD)的发生 26。此外，MSCs在骨组织方面的疾病治疗更是得到广泛应用 27，28 ，现在利用MSCs 治疗人胫骨骨折和成骨不全等均已开展了临床试验29。目前，MSCs已获得美国 FDA及中国SFDA 的批准进入 II期临床试验 30-32。近几年，由于MSCs独特的免疫原性吸引了很多基础和临床研究人员的关注。据有关报道，利用MSCs免疫调节作用治疗疾病的研究已经在许多动物模型和人类疾病患者中开展，很多MSCs的试验已经进入临床 33。目前研究表明未分化的MSCs具有很好的免疫抑制功能，但是最新的研究结果发现MSCs并不是总能抑制免疫排斥的发生，它在一些情况下同样能够促进免疫应答的发生 34。还有一些研究显示由于MSCs在体内加深了免疫应答，从而导致了治疗的失败：Sudres M等 35发现MSCs 在体外可以抑制 T细胞增殖，但是在体内没能阻止移植手术后的小鼠发生GvHD； Nauta AJ 等 36将MSCs 与异基因骨髓同时移植到受辐射后的小鼠体内，发现MSCs 可导致实验组移植入的骨髓细胞明显减少；Inoue S 等 37将MSCs与环孢霉素A（免疫抑制剂）共同使用，却加速了小鼠移植模型的排斥反应的发生；Hoogduijn MJ 等 38的研究发现MSCs 能恢复受药物抑制后的 PBMCs的正常增殖；猪的异体MSCs在体外没有免疫致敏性，但经心腔注射同时激发了细胞免疫和体液免疫应答，导致皮肤移植失败 39。Huang XP等分别移植自体和异体MSCs到大鼠梗塞的心肌中，手术3个月后大鼠心功能明显提高，但是异体MSCs分化的新生细胞在手术5个月后却消失了，已恢复的心肌功能也随之丧失。经检测发现大鼠MSCs可分化发育成肌肉、心肌或内皮细胞，但是主要组织相容性复合物（MHC）II和MHCIa表达增加，能抑制免疫排斥反应的 MHCIb表达下降，混合淋巴反应也有所增强 40。这些研究均提示MSCs在不同微环境的定向分化过程中会有免疫原性上调的现象发生。因此，我们推测这种免疫原性的上调导致了移植物在体内最终因激活宿主免疫系统发生免疫应答，影响MSCs在体内的存活、分化、组织再生和功能重建，使得MSCs的替代治疗失败。所以，研究MSCs及其在定向分化过程中免疫特性的改变和生物学作用，阐明分子机制，寻找有效的干预手段，对MSCs在临床上应用具有重要的指导意义。综上所述，MSCs具有的多向分化潜能及低免疫原性、负性调节的特性使得人胎盘源间充质干细胞成骨分化过程中免疫原性上调的研究 前 言3MSCs成为再生医学中较为理想的种子细胞。但新的证据表明，MSCs在定向分化过程中免疫原性上调，改变甚至终止MSCs的进一步分化和功能重建，其中涉及的作用机制和解决手段尚不明确，专门针对分化后的MSCs的研究目前还未有相关报道，这为MSCs在再生医学中的应用带来了新的挑战。课题组之前的研究发现人骨髓源MSCs在成软骨分化过程中CD83、CD80、CD86、B7H3 等分子表达增加，上调细胞免疫原性进而刺激T细胞增殖作用 41。那么胎盘源的MSCs是否存在不同的免疫原性和分化特性？免疫原性是否会在分化过程中发生上调？这是本研究中需要证明的主要问题，而且将要进一步做体内实验，来观察分析MSCs在体内与体外的分化是否会有区别，为MSCs将来在临床的应用收集和提供更多的数据。参考文献1 Williams A, Szabo RM. 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