禾谷孢囊线虫Heterodera avenae纤维素结合蛋白基因Hacbp1的克隆和序列分析

植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41(3)：240246(201 1) 禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合 蛋白基因(Hacbp一1)的克隆和序列分析 顾晓川 ，彭德良 ，彭焕 ，龙海波 ，王高峰 ，黄文坤 ，何月秋 ( 中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193； 。云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，昆明650201) 摘要：禾谷孢囊线虫(Heterodera ayenae)是中国小麦上的重要病原线虫。纤维素结合蛋白基因是一种重要的植物线虫寄 生和致病相关基因。用同源克隆的方法从禾谷孢囊线虫寄生前二龄幼虫中克隆出一种纤维素结合蛋白新基因Ha-c印一 (GenBank注册号GQ178086)cDNA序列。HacbpJ基因cDNA包含1个开放阅读框，编码131个氨基酸残基的蛋白质，预 测蛋白由1个长度为l8氨基酸残基的信号肽和1个纤维素结合区域(CBD)组成。Hacbp 的基因组DNA序列含有2个 内含子。预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白(HACBP一1)序列与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白(HGCBP一1)序列有 60的同一性和76的相似性，与甜菜孢囊线虫纤维素结合蛋白(HSCBP一1)序列有60的同一性和75的相似性。本 研究首次从禾谷孢囊线虫中成功克隆出CBP蛋白基因。 关键词：禾谷孢囊线虫；纤维素结合蛋白基因(Hacbp-j)；基因克隆 Molecular cloning and sequencing of cellulose binding protein gene(Hacbp一7) from the cereaI cyst nematode(Heterodera avenae) GU Xiaochuan ，PENG Deliang ， PENG Huan ，LONG Haibo ，WANG Gaofeng ，HUANG Wenkun ，HE Yueqiu ( The State Key La boratory for Biology of Disease and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China； Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pests Control，Ministry of Education，Yunnan Agricultural U niversity，Kunming 650201，China) Abstract：The cereal cyst nematode，Heterodera avenae，is an important nematode pathogen of wheat in Chi naThe cellulose binding protein genes are the important parasitism genes for invasion of plant parasitic nema todesThe cDNA sequence of Hacbp- (GenBank accession GQ1 78086)was cloned by RACE kit based on homologous cloning methodThe results showed that the cDNA sequence of Hacbp一，conmined an open rea ding frame，which encoding 13 1 amino acids with a predicted signal peptide sequence for secretion and a cellu losebinding domainThe DNA sequence of Hacbp contained two introns with the length of 932 bpThe predicted HACBPl amino acid sequence had 60identity and 75一76similarity with HSCBPl and HG CBP一1 Key words：cereal cyst nematode；cellulosebinding protein(Hacbp )；gene clone 中图分类号：$43245 文献标识码：A 文章编号：0412-0914(2011)03-0240-07 禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae Wol1，Ce real cyst nematode，简称CCN)又称燕麦孢囊线 收稿日期：2010-0311；修回日期：201l-0315 基金项目：科技部国际合作项目(2009DFB30230)；国家自然基金国际合作项目(30921140411)；公益性行业(农业)科研专项 (200903040)资助 通讯作者：彭德良，研究员，博士生导师，主要从事植物线虫分子生物学及生物安全研究；Email：dlpengippcaascn 第一作者：顾晓川(1984一)，男，河南南乐人，硕士，主要从事植物线虫分子生物学研究；Email：gxc55163tom。 3期 顾晓川，等：禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合蛋白基因( c印一J)的克隆和序列分析 241 虫，是危害小麦、大麦、燕麦、黑麦等禾谷类作物和 牧草的世界性重要病原线虫_l j。自1874年在德 国发现以来，已在世界上40多个国家发生危害，在 澳大利亚的维多利亚和南澳大利亚一般减产23 50，严重时减产73一89，年经济损失 7 000万美元 。我国自1989年7月在湖北省 天门县岳口镇首次发现以来，至今已经发现在湖 北、河南、河北、山东、山西、青海、内蒙古、北京、安 徽、陕西、甘肃、宁夏等132个省(市)均有发生分 布，发生面积约200万公顷 。 孢囊线虫侵染期二龄幼虫通过口针穿刺寄主 细胞壁进入植物根部，寻找适合的细胞建立取食位 点，进行定居阶段的寄生生活。为了维持它们在根 部侵入后的固定内寄生，孢囊线虫分泌物要刺激并 诱导寄主细胞形成复杂的取食位点合胞体，从 而引起细胞质和细胞核的改变及大量的细胞壁重 组和溶合 J。孢囊线虫在植物根部的穿刺、迁移、 形成合胞体及寄生和取食，均与口针分泌物中食道 腺细胞致病基因的表达蛋白相关 7I引。为了防御 病原线虫的侵染，植物细胞壁的机械韧度和硬度发 生了相应的进化，形成纤维素和果胶质等结构阻止 病原线虫的入侵。纤维素结合区域(Cellulose binding domain，CBD)是线虫分泌的纤维素酶与 跟植物纤维素底物结合的功能区域，单独由CBD 组成的蛋白为纤维素结合蛋白(Cellulosebinding proteins，CBPs)。CBDs可以分成l3个不同的家 族，不同家族的糖基水解酶和非水解蛋白各不相 同。CBPs通过在底物表面增加有效酶浓度来介导 纤维素酶和难溶底物的互作结合，促进纤维素的水 解) 。此外，CBPs也能促进纤维素的非水解分 解 l 。至今已经从线虫亚腹食道腺细胞和背食道 腺细胞分泌物中分离鉴定了许多种纤维素结合蛋 白及其他致病蛋白 u-13。在已克隆的植物寄 生线虫的纤维素酶和扩展蛋白中均含有和CBP高 度同源的纤维素结合域(CBD)，到目前为止已从 大豆孢囊线虫，甜菜孢囊线虫和根结线虫中克隆出 5个CBP蛋白基因_l J，但禾谷孢囊线虫中CBP 蛋白基因还没有见报道。 本文通过同源克隆的方法克隆了禾谷孢囊线 虫二龄幼虫纤维素结合蛋白基因Hacap，的cD NA及DNA序列并进行了序列分析，期望为探索 禾谷孢囊线虫与小麦等寄主植物的互作关系奠定 基础。 1材料与方法 11 孢囊收集和二龄幼虫孵化 禾谷孢囊线虫成熟孢囊采集于河南省濮阳市 南乐县近德固乡佛善村菜园南地块。用蔗糖离心 法从土壤中分离孢囊，挑取孢囊置于4c低温下处 理1个月，然后放于l6温箱中孵化二龄幼虫。 12试剂 Trizol Reagent、反转录试剂盒(SuperScriptTM 111 First-strand Synthesis System for RTPCR)、5 RACE试剂盒(5 RACE System for Rapid Amplifi cation of cDNA Ends，Version 20 kit)均购自In vitrogen公司；3 RACE试剂盒(3 一Full RACE Core Set Ver20)购自Takara公司；pGEMTeasy试剂 盒购自Promega公司；DNA Marker、DH5a感受态 细胞、凝胶回收试剂盒均购自天根生化公司。 13 总RNA和基因组DNA提取 取02 mL二龄线虫，采用Trizol法提取线虫 总RNA 培 ；采用酚氯仿抽提法提取线虫基因组 DNA 。 14目的基因片段克隆和RACE 根据已报道的大豆孢囊线虫和甜菜孢囊线虫 纤维素结合蛋白基因序列自主设计了简并引物 CBP-3B和CBP-4(表1)，以第一链cDNA为模板 进行PCR扩增，克隆目的基因cDNA核心片段。 反应参数为：94预变性5 min；94oC变性30 S， 55退火30 S，72延伸30 S；35个循环；72oC延伸 i0 min。PCR产物经电泳、切胶、回收、连接转化、 挑选阳性克隆，送上海生工生物工程技术服务有 限公司测序。根据获得的基因片段序列分别设计 3 RACE引物GSP一1、GSPM和5 RACE引物 GSP一1、GSP一2、nGSP1，进行3 和5 末端扩增，具体 步骤参照Takara和Invitrogen公司试剂盒手册。 15 cDNA全长和基因组DNA全长克隆 根据已测序获得的cDNA拼接全长序列，设 计全长引物Se-2和CBPLA2，分别以cDNA和基 因组DNA为模板进行PCR扩增。反应参数为： 242 植物病理学报 94预变性5 min；94变性30 S，53退火30 S， 72延伸l min；35个循环；72延伸10 min。 16序列分析 分别使用DNAMAN和ClustalW软件进行核 苷酸序列的翻译和氨基酸序列的比对分析，使用在 线工具http：wwwexpasychtoolspitoo1html 进行蛋白质等电点和分子量的预测，使用SignalP 30 Server在线工具http：wwwcbsdtudE servicesSignalP预测蛋白质前体信号肽，使用在 线工具http：wwwcbsdtudEservices对蛋白 质序列中可能存在的糖基化位点和磷酸化位点进 行预测。使用MEGA 40采用ME法进行分子系 统树的构建。 2结果与分析 21 Hacbp一1基因克隆结果 通过同源克隆方法扩增得到禾谷孢囊线虫纤 维素结合蛋白Hac 一J目的基因的cDNA片段 (图lA)，测序获得片段大小为115 bp。通过 BLAST比对分析表明，该片段与已报道的 一 cbpJ和Hscbp 基因有较高的同源性。经过 RACE技术分别获得其3 末端序列为641 bp(图l B)、5 末端序列为375 bp(图1-C)。利用全长引 物从禾谷孢囊线虫cDNA和基因组DNA模板中 分别克隆得到cDNA全长为464 bp(图lD)，基因 组DNA全长为932 bp(图l-E)。 Table 1 OligOnucIeOtide primers designed in experiments Number of primer Primer sequence(5 -+3 ) CBP-3B CBP_4 GSP一1 GSPM GSP一1 GSP一2 nGSPl Se2 CBPL A2 G(C)CCAATTCCTGACACCTGT(C) TCACATTCGGCTTCCCATC(T) CAGTACGCATTGGACAACACTT CTrGCTrCCAGGCGAAACTT CCCACTGCCAACCAAT GGCATCAAAAG11TCGCCTGGAAGCAAG TCCAATGCGTACTGACCACA GTCTrACTTTTITTGCTATGATrTGGAT ATGGCAATCCATCTrrGAATATGA 1OO M l M 1 M 1 M 1 M l 750 500 250 500一 bp 1 000 500一 A B C D E Fig1 PCR product of cDNA fragment(A)，3 terminal(B)，5 terminal(C)， cDNA(D)and DNA sequence(E)of CBP gene of Heterodera avenae M：DL 2000 plus marker in Fig1-A，C，D，E；DL 2000 marker in Fig1-B 3期 顾晓川，等：禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合蛋白基因(Ha-却一 )的克隆和序列分析 243 22 Hacbp-7基因序列分析 Hac 一 基因(GenBank登录号GQ178086) cDNA全长为964 bp(不包含多聚腺苷酸尾)，其中 5 端非编码区(UTR)为55 bp，3 端非编码区 (UTR)为513 bp(图2)。开放阅读为393 bp，编 码一个长度为131个氨基酸残基的蛋白，其理论分 子量为l45 kD，理论等电点为827。Hac 一 基因组DNA全长包含932 bp核苷酸，利用NCBI 在线Spidey分析，显示该基因含有2个内含子(图 3)，长度分别为117 bp和419 bp，它们都符合真核 生物基因剪接位点GTAG规则。 aataaatttggtttatttctcttaataaacctttaaaagtcttactttttttgctATGAT 60 M 工 2 TTGGATGCAATATTTTTTGTTAATATGCTTCGCCTTTTGCAGCTCATCAAAA_AGTGAGTC 120 W M Q Y F L L z C F A F C S S S K S E S 22 ATCATCATCCATTCCTAATTCGGTTACTGTACAAGTGAAACAGACAATTGGTGATACAAA 1 8 0 S S S I P N S V T V Q v K Q T I G D T N 42 TGAGTACAATTTGCAATTTATCAATGGTGTTTATCAACGGGTGTGCACTGTCATCTTTCG 2 4 0 E Y N L Q F I N G V Y Q R V C T V I F R 62 ACTTGACTTACCAAGCACAGCAACTGTGGACAAATATTCAAAAATGGTCCCAATTCCTGA 3 0 0 L D L P S T A T V D K Y S K M V P I P D 82 CACCTGTGGTCAGTACGCATTGGACAACACTTTGGACTTGCTTCCAGGCGAAACTTTTGA 3 6 0 T C G Q Y A L D N T L D L L P G E T F D 102 TGCCAAACTGTCATTGGTTGGCAGTGGGAAGCCAAATGTGACCATTCTGAGCACAAAAAA 4 2 0 A K L S L V G S G K P N V T I L S T K N 122 TATTCCAACAAACAATGCAGAAATtaaaaaacatttgatcatattcaaagatggat 4 80 I P T N K K C R N 3 tgccattttgtgattttttgagaggcaacttttcaaaatggacttttgtgggtttttttg 54 0 gggttcttgtaattcaaaaattgtatcatcactcaaaaaattgccatttttaqaqccaaa 600 atgcagagaattgttcatttgctgttgtgttttaaatgtaaataaggcttttagtataaa 660 aaaggttttttgtagttattatttagaaaatatatattttttaattttagttttatttaa 720 tattattaaaaaattttaagcccaaacaataegtaggaaacatgcgactgaaattgtcca 780 ttttttcacaeaaaaaccattcttttttgtcttgacaaaaaagttccaatatttcatctt 8 4 0 tactataaasttcatttttaaattggaaatattaaaaaaagaagaattgtcatatatatt 900 tgtcaagcaaaaatgggggtaaaattgttaatattcttcaaagcaatcggtaatctatas 960 ttccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Fig2 Complete nucleotide and deduced amino acid sequences of the cDNA of cellulose binding protein gene The predicted l8 amino acid signal peptide for secretion is indicated in bold typeA putative Olinked glycosylation site(Thr31)is underlinedA putative Nlinked glycosylation site(Asnll4)is underlinedThe TAA stop codon is marked with all asterisk and the putative polyadenylation signal sequence(aaaaaaaa)is underlined 117 bp 419 bp Fig3 The genomic sequence of cellulose binding protein gene which contained two introns 1 1 1 3 l 3 l 3 l 3 1 3 1 3 1 3 1 l l l l 1 1 1 1 0 2 如0 蝎 印 叫 植物病理学报 23蛋白质比对分析 预测的禾谷孢囊线虫纤维素结合蛋白HA CBP-1与大豆孢囊线虫纤维素结合蛋白HG-CBP l有60的一致性和76的相似性，与甜菜孢囊 线虫纤维素结合蛋白HSCBPl有60的一致性 和75的相似性，但HACBP一1比HGCBPl和 HSCBP1均少1个氨基酸残基。比对结果显示 HACBP一1与已报道的孢囊线虫CBP一样，仅有1 个信号肽和1个CBD【1 瑚，没有保守的色氨酸，但 具有大部分CBD的保守特征，如含有少量带电荷 的氨基酸残基，含有大量的羟氨基酸残基、保守的 天冬酰胺和甘氨酸残基。而根结线虫的CBP均有 1个信号肽、1个c端CBD和N端71个未知功能 的氨基酸残基 ， (图4)。同HGCBP一1一样， MACBP一1： MJCBP一1： M工一CBp一1： HSCBP一1： HGCBP一1： HACBp一1： HACBPl含有7个芳香族氨基酸，其中有4个酪 氨酸(Y44、Y53、Y74和Y87)和3个苯丙氨酸 (F48、F61和F101)，它们在CBD与纤维素酶互作 中可能起关键作用。根据在线工具预测，该氨基酸 序列存在1个潜在的0位糖基化修饰位点和1个 N位糖基化修饰位点，它们分别是第31个苏氨酸 和第114个天冬酰胺(图2)。 系统发育树分析显示3个根结线虫CBP聚为 一支，3个孢囊线虫CBP聚为一支，明显地分辨出 属、种间的亲缘关系；在孢囊线虫分支上大豆孢囊 线虫和甜菜孢囊线虫处于同1个分支，禾谷孢囊线 虫单独1个分支，说明大豆孢囊线虫与甜菜孢囊线 虫的亲缘关系较近，而与禾谷孢囊线虫的亲缘关系 相对较远(图5)。 YPSGDDLVERTTAARLHSSSDLPDDDEE ： 53 YpSGDDLVERTTAAR工JHSSSDLPDDDEE ： 53 YPSGDDLVE6珏TAARI肛8SSDLpDDDEE ： 53 ，。 。 ： 24 。 ： 24 工。 。：26 HACBP一1：ECECEDDDETTVATH工STIRSNGYPSNNGAPTSTIRPSNNGS MJCBP一1：ECIECEDDDE TVATH工STRSNGYPSNNC_kPTSTIRPSGS M工一CBP一1 ： ECECEDDDETTV TH工STRSNGYpSNNGAPTSTKRPSNNGS HSCBp一1： HGCBp一1： 。 HACBP一1： 。 ：106 ： 1O6 ： 106 ： 31 ： 31 ： 33 159 159 159 84 84 84 Fig4 Sequence alignment between deduced amino acid sequence of cellulose binding protein HACBP一1 from Heterodera avenae(GenBank Accession NOGQ178086) with a celluIose binding protein frOm other nematodes MA CBP一1，cellulose binding protein from Meloidogyne arenaria(AM491768)；MJCBP一1，cellulose binding protein from Meloidogyne javanica(AM491771)；MICBP一1，cellulose binding protein from Meloidogyne incognita(AF049139)；HSCBP一1， cellulose binding protein from Heterodera schachtii(EU328302)；HGCBP一1，cellulose binding protein from Heterodera glycines (AF469058)Identical residues between HACBP一1 with other nematode cellulose binding protein are marked with black shadow 1 1 1 1 1 l _ _ 一 一 _ 一 P P P p p P B B B B B B C C C C C C 一 一 一 - _ 一 附眦l金黔腿 1上i 1 1 1 一 _ _ 一 一 一 p P p p P p B B B B B B C G C C C C 一 _ _ _ 雌 眦聃黼舱 3期 顾晓川，等：禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)纤维素结合蛋白基因(Hac 一J)的克隆和序列分析 245 卜 O2 Fig5 Phylogenetic trees of six CBPs based on the CBPs amino acid sequence using ME method MACBP一1，cellulose binding protein from Meloidogyne arenaria(AM491768)；MJCBP一1，cellulose binding protein from javanica(AM491771)；MICBP一1，cellulose binding protein from incognita(AF049139)；HACBP-1， cellulose binding protein from Heterodera avenae GQ178086)；HSCBP-1，cellulose binding protein from H schachtii(EU328302)；HGCBP一1，cellulose binding protein from H glycines(AF469058) 3讨论 纤维素结合蛋白是一种在植物寄生线虫侵染 植物过程中的重要物质 虬 。纤维素结合蛋白最 先从食纤维梭菌中克隆得到，对纤维素的降解活性 不明显，但显示出了较高的亲和力 ，是晶状纤维 素的降解过程中不可缺少的蛋白 J。研究证实 CBD可以把纤维素酶的催化区域集中到难溶纤维 素底物的表面，从而决定对难溶纤维素的降解效 率 9 。在南方根结线虫和大豆孢囊线虫的CBP 研究中均发现CBP没有纤维素水解活性，但是具 有纤维素结合能力 5I J，2个蛋白均在寄生前和寄 生期大量表达，在成虫阶段表达量低，说明该蛋白 主要在线虫形成和维持取食位点的过程中起作 用 14,15。 本研究从禾谷孢囊线虫中克隆得到的Ha- cbp一 基因编码的蛋白质具有一个18个氨基酸残 基的信号肽和一个CBD区，信号肽的存在说明该 蛋白能够分泌到细胞外，CBD结合区可能的作用 是和寄主细胞壁的纤维素结合，有利于细胞壁的降 解。禾谷孢囊线虫的CBP序列和NCBI已登录的 大豆孢囊线虫Hac 一 和甜菜孢囊线虫的蛋白序 列具有较高的同源性，而与3个根结线虫的CBP 的同源性较低，和根结线虫相比，孢囊线虫的CBP 蛋白在信号肽后缺失一段长约70个氨基酸残基的 肽段。在聚类分析中孢囊线虫和根结线虫明显聚 为两支，这揭示的孢囊线虫和根结线虫的亲缘关 系。其结果和Sergei等 基于D2D3的分析结果 一致。在序列比对显示HA-CBP一1与HSCBP一1、 HGCBP-1的相似性为75和76，而HgCBPl 和HsCBP一1之间的相似性为94_l 。推测禾谷 孢囊线虫相对大豆孢囊线虫和甜菜孢囊线虫而言 亲缘关系较远。Haegeman等 2 推论认为线虫首 先通过水平基因转移获得纤维素酶和扩展蛋白，其 蛋白均含有CBD结合域，在线虫进化过程中，降解 纤维素的水解糖苷酶和扩展蛋白的扩展结合域发 生丢失而形成了纤维素结合蛋白CBP。 在内含子比较中，HACBP一1含有2个长度为 117 bp和419 bp的内含子序列，而大豆孢囊线虫 含有一个内含子，根结线虫含有长度不等的3个内 含子，说明不同种的线虫间内含子的位置和数量具 有多态性。 本文从禾谷孢囊线虫二龄幼虫中克隆到的 Hacbp一 cDNA序列，其蛋白序列HACBPl与 HG-CBPl、HSCBP-1有60的一致性，表明它们 有共同的来源，在线虫侵入植物的过程中可能有同 样的功能。本研究只研究了禾谷孢囊线虫纤维素 结合蛋白序列信息，并对基因功能进行了预测，后 续研究将通过半定量RTPCR明确该基因在禾谷 孢囊线虫不同发育阶段的表达特性，通过dsRNA 介导的鼢 干涉(RNd)方法证实该蛋白在线虫形 成和维持取食位点的过程中所起的作用，以期能为 将来研究防治禾谷孢囊线虫的对策提供一些参考。 参考文献 1 Webster J MNematodes and biological controlM London and New York：Academic Press Inc，1972 2Niche W RPlant and insect nematodesMNew York&Basel：Marcel Dekker，1984260276 246 植物病理学报 41卷 3 Ou S Q，Peng D L，Li YResearch progress on mo lecular diagnosis and resistance genes of the cereal cyst nematode，Heterodera avenae(in Chinese)l J IPlant Protection(植物保护)，2008，34(6)：711 4Peng D L，Li H X，Wang X F，et a1New distribution of cereal cyst nematode(Heterodera avenae)in China ALiao J L，Peng D L，Duan Y 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