枯草杆菌芽孢的高压热处理杀菌效果研究VIP

学校代码：_11059_学 号：_1202021026_Hefei University毕 业 设 计 （ 论 文 ）BACHELOR DISSERTATION论文题目：枯草杆菌芽孢的高压热处理杀菌效果研究学位类别： 理学学士 学科专业： 生物技术 作者姓名： 刘耀文 导师姓名： 谢宁宁 完成时间： 二一六年六月 12 级生物技术专业毕业论文I枯草杆菌芽孢的高压热处理杀菌效果研究摘 要为了进一步探索高压热处理(HPTS)对芽孢的杀灭效果和机理，为低酸性食品的高压生产应提供理论依据，本研究将枯草杆菌芽孢在富集Mn 2+的培养基上于37 下培养7天后悬浮于无菌去离子水中，经过18、38、43、50、58 下，300和500 MPa分别保压0 、5、10、20 min的HPST杀菌处理。再利用平板计数评价HPTS 的杀菌效果；采用胞外电导率评价阳离子泄露率；以流式细胞染色结果衡量芽孢内膜透性变化；以胞外紫外吸收物质（A 260和A 280）含量表征核心损伤程度；测量菌群萌发率和胞外2,6-吡啶二羧酸(DPA) 含量判断芽孢是否萌发。研究取得如下结果：1. 常温高静压（18、38 ）对芽孢的钝化效果不明显，HPTS对芽孢的作用受温度、压力和保压时间的影响。基本上，随着温度升高、压强增加、保压时间延长，杀菌效果越好。本实验中杀菌效果最好的条件为58 ，500 MPa下保压20 min，达到2.1个对数值。2. 所有条件的温度结合超高压实验处理，都显著破坏了芽孢内膜，与芽孢DNA结合并发射强荧光，当处理条件为50 ，300 MPa下保压5 min时对枯草杆菌芽孢紫外吸收物质泄漏的影响最大。3. 在其他条件一致的情况下，温度越高、压强越大、保压时间越长则芽胞萌芽率越低，本次实验使芽孢萌芽率最低的处理条件为500 MPa，58 ，20 min。关键词:HPTS；枯草杆菌芽孢；杀菌效果；阳离子泄露率；芽孢内膜透性12 级生物技术专业毕业论文IIInactivation effect of high pressure thermal sterilization on Bacillus subtilis sporesABSTRACTThis study aims to further explore the inactivation effect and mechanism of high pressure thermal sterilization (HPTS) on Bacillus subtilis spores, and promote the development of low acid food non-thermal processing technologies. Bacillus subtilis spores were cultivated on culture medium rich in Mn2+ at 37 for 7 days then suspended in sterile de-ionized water. Then HPTS process was carried at 18, 38, 43, 50 and 58 under 300 and 500 MPa for 0, 5, 10 and 20 min respectively. By means of plate count the inactivation effect of HPTS on spores was evaluated, the permeability of membrane was measured by flow cytometry staining; extracellular ultraviolet absorption substance (A260 and A280) content was used to characterize the core damage; flora germination rate and the cell outer 2,6-pyridine dicarboxylic acid (DPA) level measurement was to observe the spore germination. Research results were as follows,1. In the case of other conditions consistent, the higher the temperature, the greater the pressure, the longer the duration of the sterilization effect is better, the best results of this experiment is 500 MPa, 58 degrees Celsius, 20 min.2. Combined with the experiment of ultra high pressure treatment conditions under all temperature, significant damage to the Endospore, and bacillus DNA binding and strong fluorescence emission when the processing conditions of 300 MPa and 50, 5 min of Bacillus subtilis ultraviolet absorption substance leakage effect of the largest.3. Under the same other conditions, the higher the temperature, pressure is big, Paul pressure time longer, spore germination rate is low, the experiment the spore germination rate the lowest processing conditions for 500 MPa and 58, 20 minutes.KEY WORD: HPTS treatment；Bacillus subtilis spores；Inactivation effect；Cation leakage rate； Spore permeabilit2012 级生物技术专业毕业论文目 录摘要ABSTRACT1 前言 .11.1 立题依据 .11.2 国内外研究进展及发展动态分析 .21.3 研究目的 .31.4 研究内容 .31.5 技术路线 .42 材料与方法 .52.1 实验材料 .52.2 实验仪器及试剂 .52.2.1 实验仪器 .52.2.2 实验试剂 .52.3 HPP.L1-600/3 超高压处理设备 .62.4 实验方法 .72.4.1 枯草杆菌芽孢的培养及菌悬液制备 .72.4.2 高压热处理 .72.4.3 杀菌效果测定 .72.4.4 芽孢细胞结构和内膜透性 .72.4.5 芽孢萌发情况 .82.4.6 统计分析 .83 结果分析与讨论 .93.1 温度结合超高压对枯草杆菌芽孢的钝化效果 .93.2 温度结合超高压对枯草杆菌芽孢电导率的影响 .103.3 温度结合超高压对枯草杆菌芽孢折光性的影响 .113.4 温度结合超高压对枯草杆菌芽孢 DPA 泄漏率的影响 .113.5 温度结合超高压对枯草杆菌芽孢紫外吸收物质泄漏的影响 .123.6 温度结合超高压对枯草杆菌芽孢细胞膜通性的影响 .134 实验结论 .15参考文献 .16致 谢 .1812 级生物技术专业毕业论文11 前言1.1 立题依据细菌芽孢不仅破坏食品品质，而且还威胁人体健康，危害性比较大。传统中式菜肴为低酸性食品（pH4.5 ），其工业化程度低的原因之一是由于其中的抗逆性极强的芽孢容易导致食物腐败。食品中引起腐败及食源性疾病的典型芽孢细菌是芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属 1。其中，最重要的食源性芽孢细菌包括可能导致窒息的肉毒梭状杆菌 2和造成超高温灭菌牛奶腐败的枯草芽孢杆菌等 1。传统高温高压的加工方式虽然可以杀灭抗性极强的芽孢，但它会导致食品发生香气破坏（香变）、颜色变化（色变）、质构变化（形变）、味道改变（味变）、营养损失（养变）、新鲜度破坏等 3，所以亟需探索超高压等新型杀菌技术。目前研究已证实了常温下超高压技术（1001000 MPa）能有效地杀灭细菌营养体、酵母菌、霉菌、病毒等，但是细菌芽孢极其耐压 4。Moeller R等报导在撞击产生高达50 GPa的瞬间压力下岩石中的枯草杆菌芽孢仍残留活性，这可能是芽孢耐压最极端的例子。所以，超高压技术虽然能很好地应用于高酸食品，但对于低酸食品（pH4.5 ）必须冷藏才能防止芽孢萌发而导致食物腐败，给产品的贮运带来不便，这是超高压技术最大的不足。所以超高压技术需要结合热处理或化学试剂、杀菌剂等措施杀灭细菌芽孢 5。高压热处理技术是一种新兴食品加工技术，该技术是利用压力和温度的协同效应，不仅保持了食品的营养和感官品质，而且提高了杀菌效果。研究表明，每当温度每升高 10 ，食品的营养和感官品质的破坏速度就会增加约 23 倍，因此降低杀菌温度可以保护食品的品质 6。HPTS 技术处理温度在 5080 间，与巴氏杀菌的温度很相似，比起传统的高温高压杀菌和 UHT 杀菌的温度低得多，仍属非热加工范畴，可以较好的保存食品的营养成分和品质。同时，由于HPTS 比起常温超高压提高了处理温度，因此对微生物特别是耐压芽孢的杀灭效果明显提高。HPTS 于 2009 年 2 月获得美国 FDA 批准用于低酸性食品杀菌。与传统灭菌方式相比，HPTS 技术有着下面几个优点：HPTS 处理技术能很好地保持食品中原有的色、香、味、营养素和功能性成分；能延长各种低酸性食品在常温下的保存时间，在低酸性食品的常温保藏上具有很大的应用优势；HPTS 为纯物理杀菌过程，不添加任何防腐剂，更加安全；HPTS 使用电力，对环境污染较小，且在保压杀菌期间，基本无需耗能，节能环保。但是 HPTS12 级生物技术专业毕业论文2的一些杀灭芽孢机理和效果研究仍不完全，为了进一步探索 HPTS 杀灭芽孢的机理和效果，所以进行了这项研究。1.2 国内外研究进展到目前为止，HPTS杀灭芽孢的机理研究不够清晰，而且对于芽孢是否萌发仍存在着一些不同的看法，HPTS杀灭芽孢的机理和效果仍在不断探索研究当中。Roberts等人于1996年发现在70 、400 MPa的处理条件下能有效杀灭嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。Mils等人于1998年发现在400 MPa、60 、30 min的处理条件下能有效杀灭芽孢。Stewarts等人于2000年发现了在404 MPa、70 、15 min的处理条件下能杀灭约5个对数的枯草杆菌芽孢，而在室温下几乎没有任何杀灭效果。Okazaki 等人于2000 年发现了HPTS对不同菌种芽孢的作用效果是不同的。Lee等人于 2002年发现了高压结合中温（45 、71 或90 ）能够杀灭苹果汁中含有的的酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢。Reddy等人于 2003年发现了HPTS 能够有效杀灭蟹肉棒中的肉毒杆菌芽孢，而且当处理压力越高、温度越高或时间越长时，对细菌的杀灭效果也就越好。Gao等人于2006年发现，压力、温度和时间是杀灭芽孢的3个关键因素。Estrada等人于2007年发现压力、温度和时间的组合在550620 MPa、7090 、2 s15 min范围内时，能够有效杀灭豆奶中的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢。2008年Robertson等人发现了在 600 MPa、75 、60 s的处理条件下能有效杀灭复原脱脂乳中的细菌芽孢。Ju 等人于2008年研究了HPTS（ 400600 MPa、6080 、1020 min）杀灭牛奶中蜡样芽孢杆菌芽孢的效果，通过响应面法分析，发现540 MPa、71 、16.8 min是杀灭6个对数芽孢的最佳条件。Wang等人于 2010年发现了凝结芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌在鸡腿菇中对HPTS的抗性比其在磷酸缓冲液中的抗性要高，且凝结芽孢杆菌芽孢比嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的抗性低 6。此外，我国研究人员也为此项研究做出了巨大贡献，比如黄娟和高瑀珑等人的研究揭示了HPTS的一些作用机理。黄娟等人在2008年时初步研究了HPTS的在升压过程中对凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢失活、发芽、损伤产生的影响，他们发现了热是造成芽孢损伤的一个重要因素且热力和压力的协同作用十分明显。高瑀珑等人在2007年研究了HPTS对枯草芽孢杆菌与嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的影响，结果表明HPTS能够破坏芽孢结构，显著提高芽孢DPA的泄漏率，而DPA 与芽孢DNA的稳定性有关 6。这些成果都极大的推动了HPTS杀灭芽孢的机理研究。12 级生物技术专业毕业论文31.3 研究目的本研究的目的意义，主要体现在如下几点：采用HPTS技术杀灭枯草杆菌芽孢，测量不同条件的HPTS 处理的杀菌效果，探索HPTS杀灭芽孢的规律；观察HPTS下芽孢的内容物泄露、萌发等，研究HPTS 对芽孢的物理、化学、生理等不同作用方式；有助于了解高压杀灭细菌芽孢的机理，并为探索低酸性食品的非热加工技术的研发提供理论依据，推动低酸性食品保藏新技术的发展。1.4 研究内容明确HPTS对枯草杆菌芽孢的杀菌效果：根据已有研究，设计不同水平压力、温度、保压时间的HPTS处理，评价HPTS 对枯草杆菌芽孢的杀菌效果。观察HPTS对枯草杆菌芽孢的细胞结构和内膜透性的破坏效果：以HPTS处理后菌悬液中的紫外吸收物质（A 260和A 280）含量表征核心损伤程度，采用菌悬液中的胞外电导率评价阳离子泄露率，以流式细胞染色结果衡量芽孢内膜透性变化。观察HPTS对枯草杆菌芽孢的萌发情况的影响：以HPTS处理后菌悬液的折光性和DPA泄露率评价芽孢的萌发情况。12 级生物技术专业毕业论文41.5 技术路线图 1 技术路线图枯草杆菌培养菌悬液不同条件 HPTS 处理杀菌效果平板计数细胞结构内膜电导率膜孔径紫外物质萌发情况萌发率DPA 泄露折光性12 级生物技术专业毕业论文52 材料与方法2.1 实验材料本实验菌种选择的是枯草杆菌，购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心。2.2 实验仪器及试剂2.2.1 实验仪器表 1 实验仪器实验仪器 生产厂家电子天平分析天平高压蒸汽灭菌锅微电脑电磁炉冰箱震荡仪微波炉超净工作台DHP-9082 智能生化培养箱1900PC 型双光束紫外可见分光光度计HPP.L1-600/3 超高压处理设备雷磁 pHS-3C 型 pH 计BD FACSCalibur 流式细胞仪德国赛多利斯股份有限公司德国赛多利斯股份有限公司上海市三申医疗器械有限公司荣事达集团海尔集团上海沪西分析仪器厂有限公司广东省顺德区格兰仕有限公司上海上净净化设备有限公司上海一恒科技有限公司上海谱元仪器有限公司天津华泰森淼技术股份有限公司上海仪电科学仪器股份有限公司美国 Becton Dickinson 公司2.2.2 实验试剂表 2 实验试剂实验试剂 生产厂家营养琼脂（NA）一水合硫酸锰（硫酸锰）氯化钠胰蛋白胨大豆琼