载体构建毕业论文

SUR1 基因的组织定位目录摘要 .- 1 -1前言 .-3 -1.1 研究背景 .- 6 -1.2User fusion 技术简介 .- 5 -2.实验材料和方法 .- 7 -2.1SUR1 启动子的克隆 .- 7 -2.2 转化农杆菌 .- 9 -2.3 农杆菌侵染法侵染拟南芥 .- 9 -2.4Basta 筛选转基因拟南芥 .- 11 -3.结果 .- 11 -3.1SUR1 启动子 User fusion 克隆结果 .- 11 -3.2 启动子 PCR 产物与载体连接 .- 13 -3.3 大肠杆菌中 SUR1 启动子菌落 PCR 检测结果 .- 14 -3.4 SUR1 启动子农杆菌的 PCR 检测 .- 15 -3.5 Basta 筛选结果 .- 16 -4.讨论 .- 18 -参考文献 .- 19 -致谢 .- 20 -SUR1 基因的组织定位摘要：芥子油苷是一类十字花科植物所特有的硫代产物，芥子油苷代谢与植物防御反应密切相关，且某些芥子油苷的降解产物具有很高的抗肿瘤活性，因而其代谢及调控机制的研究备受关注。随着生物信息学的发展以及芥子油苷合成途径中相关基因的鉴定，SUR1 基因参与硫苷生物合成模式三个阶段中硫苷核心结构的形成阶段，SUR1 表达的 C-S lyase SUR1 能将 S-烷基硫代烷肟转换成硫代肟基酸。本研究以模式植物拟南芥为实验材料。采用 USER fusion，构建载体，农杆菌转化，GUS 染色等方式，观察其表达模式，完成其组织定位，结果用以和其他已知的芥子油苷合成路径中的一些相关的基因进行表达上的对比，通过这中方式探讨 SUR1 基因在芥子油苷的合成途径中的功能意义，以及 SUR1 基因时空表达的特异性。关键词：芥子油苷,拟南芥 ,SUR1 ,USER fusionSUR1 基因的组织定位Abstract: is a class of sulfur-containing secondary metabolism outcomes specialized in Cruciferous plants. Glucosinolates have an important role in plant defense and some of the glucosinolates degradation products can prevent cancer in humans. Today, the researching about the glucosinolates metabolism and its biosynthesis regulation is under the spotlight. Along the development of bioinformatics and the demonstration of the new genes which involve the biosynthesize of glucosinolates,，SUR1 take part in the process Constructing the glucosinolate core,which can happen non-enzymatically, the produced S-alkylthiohydroximates are converted to thiohydroximates by the C-S lyase SUR1。In this study ，we use the model plant Arabidopsis as experimental material,USER fusionconstruct vectors, Agrobacterium-mediated transformation,GUS ,to observe expression pattern and complete its tissue localization.the results are usedand some other known mustard oil glycoside synthesis route related gene expressioncontrast. the functional significance of the SUR1 gene in the biosynthesis ofglucosinolates this way SUR1 gene temporal and spatial expression specificity.Key wordGlucosinolates , Arabidopsis thaliana , SUR1 , USER fusion1 前言SUR1 基因的组织定位1.1 研究背景硫代葡萄糖苷即芥子油苷简称硫苷，是一种含氮、硫的化合物。芥子油苷广泛分布于16 个不同科的双子叶被子植物中, 它们分别是十字花科( Brassicaceae) 、藜木科( Bataceae) 、钟萼木科( Bretschneideraceae) 、白花菜科( Capparaceae) 、番木瓜科( Caricaceae) 、大戟科( Euphorbiaceae) 、环蕊科( Gyrostemonaceae) 、池花科( Limnanthaceae) 、辣木科(Moringaceae) 、瘤药树科( Pentadiplandraceae) 、商陆科( Phytolaccaceae) 、海桐花科( Pittosporaceae) 、木犀草科( Resedaceae) 、刺茉莉科( Salvadoraceae) 、烈味三叶草科( Tovariaceae)和旱金莲科( Tropaeolaceae)1。最主要是存在于十字花科植物中，十字花科植物中超过350 个属和3 000 个种都可以合成芥子油苷。是一种重要的植物次生代谢产物。芥子油苷既分布于植物的生殖器官( 花序、角果/果实、种子) , 也存在于营养器官( 根、茎、叶) 2。在同一植物中芥子油苷的含量和成分明显依赖于株龄3, 4和组织器官而发生变化。近年来，由于其在黑芥子酶作用下的分解产物异硫代氰酸盐在人体抗癌方面的健康功效而不断受到大家的重视。增加食品中的芥子油苷含量和充分发挥其分解物的生物有效性已经成为现今的一个研究热点。芥子油苷一般贮存于植物细胞液泡中，而芥子酶贮存于特定的蛋白体中，一般情况下二者是分离的，当植物组织受到病原体或虫害侵袭时，细胞组织被破坏，芥子酶与硫苷相遇，发生反应，将硫苷水解成异硫氰酸盐（Isothiocyanates）、硫氰酸脂（Thiocyanates）和腈类（Nitriles）等降解产物7。硫苷及其降解产物能调节十字花科植物的生长素代谢，平衡体内的硫元素，缓解硫素胁迫，保证植物正常生长发育，抵御病原体及虫害侵袭，此外，还对癌症的发生起阻断作用。在植物防御与人类营养学上起着重要的作用，具有很高的生物学价值与经济价值。芥子油苷通常由-D-硫葡萄糖基、硫化肟基团以及来源于氨基酸的侧链R组成(图1) 。目前至少有120种不同的结构被确定 5 。根据侧链的氨基酸来源可以将芥子油苷分为脂肪族芥子油苷(侧链来源于甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸) 、芳香族芥子油苷(侧链来源于苯丙氨酸和酪氨酸)和吲哚族芥子油苷(侧链来源于色氨酸) 3个类群。SUR1 基因的组织定位硫苷生物合成模式大致可分为三个阶段：氨基酸侧链的延长、硫苷核心结构的形成和葡萄糖配基侧链的二次修饰。硫苷的有无与含量的高低是由基因来控制的，相关的主要合成和调节基因参与硫苷合成的三个阶段。氨基酸或氨基酸侧脸延长筒源无可经由细胞色素P450(CYP450)家族的CYP79s(CYP79subfamily)和NADPH催化转变为相应的肟。肟形成后被CYP83s(CYP83subfamily)和NADPH催化产生不稳定的酸式硝基化合物或氧化氰。二者均可与硫供体半胱氨酸结合，在谷胱甘肽硫转移酶作用下生成S-烷基硫代烷肟，之后在C-S裂解酶的催化下生成的硫代肟基酸经S葡萄糖基转移酶的作用下，与活化硫酸盐的磺基结合形成芥子油苷的硫核心结构，该核心结构之后再需要经过羟基化、甲基化、去饱和化、磺化、葡萄糖基化等种种次级修饰形成不同的芥子油苷。本研究所涉及的SUR1基因是在硫苷核心结构的形成阶段起重要作用：在硫苷核心结构形成的阶段中SUR1表达的C-S lyase SUR1 能将 S-alkylthiohydroximates（S-烷基硫代烷肟） 转换成 Thiohydroximates（硫代肟基酸）6从而保证下一步反应的进行(见图2)。本研究旨在完成该基因的组织定位。SUR1 基因的组织定位图2：脂肪族与吲哚族芥子油苷的生物合成路径1.2 USER fusion技术简介USER fusion技术的基础理论是依赖于PCR引物的使用，该引物包含一个12-nt 5尾部中至少含有四个脱氧胸腺嘧啶核苷（Ts）被替换成脱氧尿苷（Us） ，之后PCR产物被尿嘧啶-DNA糖苷酶（uracil DNA glycosidase即UDG）处理，这种酶可以选择性的切除尿嘧啶碱基，而保留磷酸二酯骨架的完好性，缺失的碱基位点会使碱基互补配对不稳定。实验结果中，SUR1 基因的组织定位引物的3突出端在退火过程中同样的在PCR扩增载体3突出端互补配对。处理后的PCR产物和载体能形成一个可被转入一个不需结扎的大肠杆菌之中的稳定环状杂交产物。随着技术的发展，第二种酶被引入PCR产物的处理中T4核酸内切酶V ，可以在3端破坏DNA磷酸二酯骨架制造一个脱碱基位点。因此，UDG 和T4内切核酸酶V连续作用在PCR产物中，与一个3端含有单U残基的引物一起，可以有效地被用于克隆。商用公司通过一种简单的双酶处理法将两种酶混合到一起，称为USERTM enzyme mix，并作出一定程度上的优化改进。这种USER fusion技术被认为是一种高效率且通用性强的技术。82实验材料与方法2.1 SUR1启动子的克隆启动子是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA 准确地相结合并具有转录起始的特异性，即启动子是 RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA 序列，启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达的起始时间和表达的程度，本身不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的蛋白质结合而控制基因活动的。一般认为目的基因上游约2kb即包含目的基因启动子片段，由于所需克隆的片段较长，故选择 USER fusion方法来克隆这段目的基因片段，这种方法通用性强，并且准确率和效率都比较高。2.11 多聚酶链反应扩增包含SUR1启动子全长cDNA的质粒模板，寡核苷酸引物序列从Invitrogen公司购买， 依照说明书使用PfuTurbo CX Hotstart DNA聚合酶行驶反应。所涉及引物序列见表一（A、B）引物 序列SUR1启动子FP 5-GGCTTAAUTATTGCATTGCTACTTTGTGGTT-3SUR1启动子RP 5-GGTTTAAUCTTCTCTCTGTGCTTTGAGTTCTT-3表一（A）SUR1启动子引物引物 序列SUR1启动子fusion FP1 5-ATCTGGUATTAACTTGAAACTTTCACACTTCT-3SUR1 基因的组织定位SUR启动子fusion RP1 5-ACCAGAUTTTCATTACTTTCATTTAAAGTTCG-3 SUR1启动子fusion FR2 5-ATAGTCUAAAAATAGAAATTTGTTGACCAAG-3SUR1启动子fusion RP2 5-AGACTAUGGGTGCAAATGTTGTTTG-3表一（B）SUR1启动子USER fusion 引物2.12 DNA纯化根据厂家说明书用QIAquick PCR纯化工具对PCR产物进行柱相纯化，纯化产物以原体系的三分之一的蒸馏水进行洗脱。2.13 纯化的PCR产物与预备载体的结合等体积的纯化PCR产物连同等体积的带有PacI/Nt.BbvCI的预备载体pCambia3300一起，于琼脂糖凝胶上进行跑胶，通过条带亮度分析相对浓度，决定混合配比3:3:3:1 。2.14 用USERTM enzyme mix处理一微升10 TE buffer【100mM Tris-HCl, 1mMEDTA (pH 8.0)】、1U 的 USERTM enzyme mix(1U/L)加到8 L预备载体和PCR纯化产物的混合物，反应在 37的温度下孵育20分钟，接着在25的条件下反应20分钟，预备载体在反应混合物中的量大概占 0.01 pmol.2.15 转化全部10L的反应混合物与50L 感受态大肠杆菌细胞进行热激反应2.16 质粒的准备与限制性分析依照厂家说明书，使用GenEluteTM 质粒小量制备工具，4ml过夜培养，被纯化的质粒用50L的水洗脱，在一个20L 包含1 NEB Buffer 250mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM dithiothreitol (pH 7.9)和100L/ml BSA的反应体系中每两微升质粒用10U的SpeI,37条件下切割2 小时。在含有卡那霉素固体培养基中筛选，PCR和酶切鉴定重组质粒，取阳性克隆菌落。载体示意图如图3SUR1 基因的组织定位图3：载体示意图所构建载体为二元载体，Basta为在植物体中的筛选标记，Kana为菌体中的筛选标记。所连接的GUS基因用于后续组织定位之用。2.2 转化农杆菌重组表达载体导人农杆菌。用电转化法将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中，电转化参数为：电压2 500 kVem；电容25 F；电阻500 Q。电击35 ms后，取出电击杯，迅速加入800 L的LB液体培养基，混匀并转移至15 mL的EP管中，在28震荡培养3 h；取100,L菌液涂布于含Gen(50,gmL)和Kan(50,gmL)的LB平板中28培养24 h，即可长出阳性克隆。阳性克隆的菌落PCR与酶切鉴定。随机挑取单菌落，在装有1 mL的LB和15 mL的抗生素的离心管中28培养12 h左右。取5O L培养物，煮沸5 rain，5 000 rrain离心2 min，取12,L上清进行PCR扩增后电泳检测。选取菌落PCR验证后的菌液抽提质粒，并用BstE 1I和Bgl 1I双酶切后，电泳检测。2.3 农杆菌浸染法侵染拟南芥前期准备：取 150ml 含相应抗生素的液体 LB 培养基，接入 2-3ml 准备好的农杆菌菌液，大摇过夜至培养基由红色转为黄色。将培养后的 150ul 农杆菌菌液