双歧杆菌与嗜酸乳杆菌最适混合培养条件的研究与产品开发

分 类 号 _ 密 级 _UDC _ 编 号 .硕 士 学 位 论文双歧杆菌与嗜酸乳杆菌最适混合培养条件的研究与产品开发学 位 申 请 人 ： 赵 磊 _指 导 教 师 ： 秦 翠 丽 副 教 授 学 科 专 业 ： 生物化学与分子生物学 学 位 类 另 IJ: 理学 _2009年 12月论文题目： 双歧杆菌与嗜酸乳杆菌最适混合培养条件的研究与产品开发专 业： _生物化学与分子生物学研 究 生 ： _赵 磊 _指导教师： _秦 翠 丽 副 教 授摘 要双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 是 一 类 重 要 的 益 生 菌 ， 具 有 保 持 肠 道 菌 群 平 衡 、 增 强 机 体 免 疫 力 、 防 治 胃 肠 道 疾 病 等 益 生 功 能 ， 因 此 ， 益 生 菌 及 其 产 品 开 发 越 来 越 成 为 研 究 的 热 点 ， 但 由 于 绝 大 多 数 益 生 菌 不 耐 氧 、 不 耐 酸 、 易 失 活 ， 且 不 同 菌 株 之 间 还 会 出 现 拮 抗 现 象 ， 一 定 程 度 上 限 制 了 其 开 发 应 用 与 效 能 。 为 提 高 益 生 菌 的 活 菌 数 和 适 应 能 力 ， 本 研 究 以 青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 为 试 验 菌 株 ， 开 展 了 以 下 研 究 ：1. 青 春 双 歧 杆 菌 与 嗜 酸 乳 杆 菌 单 独 培 养 最 适 培 养 条 件 的 研 究(1) 碳 源 的 优 化 在 不 含 碳 源 的 MRS培 养 基 中 分 别 加 入 2%的 菊 粉 、 蔗 糖 、 葡 萄 糖 、 乳 糖 和 淀 粉 制 成 培 养 基 。 将 两 菌 分 别 按 1%的 量 接 入 制 备 的 培 养 基 中 培 养 。 结 果 ， 两 菌 都 能 利 用 菊 粉 、 蔗 糖 、 乳 糖 、 葡 萄 糖 ， 不 能 利 用 淀 粉 ； 在 含 菊 粉 的 培 养 基 中 生 长 较 好 ， 而 在 含 蔗 糖 、 乳 糖 的 培 养 基 中 生 长 存 在 延 滞 期 。(2) 氮 源 的 优 化 采 用 四 因 素 三 水 平 正 交 试 验 设 计 ， 在 不 含 氮 源 的 MRS培 养 基 中 ， 分 别 按 0.3%、 0.6%、 0.9%的 量 加 入 酵 母 膏 （ A)， 蛋 白 胨 （ B)， 大 豆 蛋 白 胨 （ C)和 牛 肉 膏 （ D)制 成 培 养 基 。 将 两 菌 分 别 按 1%的 量 接 入 制 备 的 培 养 基 中 培 养 。 结 果 ， 影 响 因 素 呈 现 ACBD。(3) 益 生 元 的 优 化 在 MRS培 养 基 中 分 别 加 入 1%的 水 苏 糖 、 低 聚 果 糖 、 低 聚 异 麦 芽 糖 制 成 含 益 生 元 的 培 养 基 ， 将 两 菌 分 别 按 1%的 量 接 入 制 备 的 培 养 基 中 培 养 。 结 果 ， 这 3种 低 聚 糖 对 青 春 双 岐 杆 菌 生 长 影 响 显 著 ， 而 对 嗜 酸 乳 杆 菌 的 影 响 不 明 显 ， 尤 其 是 低 聚 果 糖 对 青 春 双 岐 杆 菌 生 长 的 影 响 效 果 比 水 苏 糖 、 低 聚 异 麦 芽 糖 较 显 著 。2. 青 春 双 歧 杆 菌 与 嗜 酸 乳 杆 菌 混 合 培 养 最 适 生 长 条 件 的 研 究通 过 单 因 素 试 验 和 RSA响 应 面 分 析 法 优 化 了 两 菌 混 合 培 养 条 件 ， 探 讨 了 两 菌 不 同 浓 度 配 比 、 pH值 、 低 聚 果 糖 的 不 同 添 加 量 对 混 合 培 养 生 长 的 影 响 。 结 果 ， 两 菌 浓 度 配 比 1:1、 pH值 6.512、 低 聚 果 糖 的 添 加 量 1.499%时 ， 两 菌 在 混 合 培 养 体 系 中 有 良 好 的 微 生 态 关 系 。I3. 青 春 双 歧 杆 菌 与 嗜 酸 乳 杆 菌 活 菌 体 收 集 得 率 的 研 究为 确 定 两 菌 活 菌 体 的 最 佳 收 集 得 率 ， 采 用 离 心 时 间 、 离 心 速 率 ， 做 两 因 素 三 水 平 正 交 试 验 ， 结 果 ， 在 4C、 6000r/min的 条 件 下 离 心 30min， 活 菌 得 率 最 高 ， 为 83.1%。4. 青 春 双 歧 杆 菌 与 嗜 酸 乳 杆 菌 新 产 品 的 研 制将 青 春 双 歧 杆 菌 、 嗜 酸 乳 杆 菌 和 益 生 元 复 配 ， 采 用 不 同 方 法 制 备 合 生 元 微 胶 囊 、 硬 胶 囊 以 及 液 态 制 剂 ； 并 对 所 制 产 品 进 行 耐 胃 酸 试 验 、 肠 道 崩 解 试 验 和 人 工 胃 、 肠 液 联 合 作 用 试 验 。 结 果 ， 相 同 条 件 下 ， 合 生 元 微 胶 囊 比 合 生 元 硬 胶 囊 、 合 生 元 液 态 制 剂 存 活 率 高 。 合 生 元 微 胶 囊 经 人 工 胃 液 消 化 2h后 存 活 率 可 达 70.8%； 在 人 工 肠 液 经 50min降 解 充 分 ， 溶 出 率 达 到 96.7%； 经 人 工 胃 液 、 肠 液 联 合 作 用 后 存 活 率 仍 可 达 66.8%。关 键 词 ： 青 春 双 歧 杆 菌 ， 嗜 酸 乳 杆 菌 ， 响 应 面 分 析 法 ， 合 生 元 ， 微 胶 囊 论文类型：应 用 基 础 研 究IISubject: The optimal conditions study and product development in mixed culture for Bifidobacterium and Lactobacillus acidophilusSpecialty: Biochemistry and Molecular Biology _Name: _Zhao Lei_Supervisor: _Qin Cui-li Associate Professor _ABSTRACTBifidobacterium and Lactobacillus acidophilus is found as an important class of probiotics which has the prebiotic function, such as, maintain the balance of intestinal microbial flora, enhance immunity, prevention and treatment of various gastrointestinal diseases and so on. Therefore, probiotics and product development is increasingly becoming a hot research. However, because most of the probiotics is oxygen-intolerant, non-acid and easy deactivation, also it will emerge antagonistic phenomena between different strains, etc., which has limited their development and application and performance in some degree. In order to increase the number of viable probiotics and adaptive capacity, in this study, we take Bifidobacterium and Lactobacillus acidophilus as the two test bacteria and carry out studies as below:1. The study of optimal conditions in pure Culture for Bifidobacterium and Lactobacillus acidophilusOptimization of carbon source: Made medium by adding 2% of inulin, sucrose, glucose, lactose and starch in the MRS medium which without carbon source. Then re-spectively inoculated 1% volume of two bacteria to a medium and cultured. The result shows that two strains can absorb the inulin, sucrose, lactose and glucose, but cannot absorb starch; can grow well in the carbon sourses with inulin, however, have lags in the carbon sourses which with sucrose or lactose.(2) Optimization of nitrogen source: Using four factors and three levels orthogonal experimental design, adding yeast ex-tract (A), peptone (B), soy peptone (C), and beef extract (D) with amount of 0.3%, 0.6% and 0.9% in the MRS medium which without nitrogen source. Then respectively inoculated 1% volume of two bacteria to a medium and cultured. Results, the four factors shown that A C B D.(3) Optimization of Prebiotics: Made prebiotics medium by adding 1% stachyose, fructooligosaccharides, Isomaltooligosaccharide in the MRS medium, thenIIIrespectively inoculated 1% volume of two bacteria to a medium and cultured. The result shows that these three kinds of oligosaccharides have more significant impact on growth of B.adolescentis, while there is no significant effect on growth of L. acidophilus, especially, fructooligosaccharides has more significant effect on growth of B.adolescentis than stachyose and Oligo-isomaltose.2. Optimization of growing conditions in mixed culture between B.adolescentis and L. acidophilusOptimization the mixed culture conditions of two bacteria by single-factor test and RSA response surface method, discussed the affects on the growth of mixed culture if by different concentrations ratio between two bacteria, pH value and different dosage of fructooligosaccharides for the mixed culture. The results shows that when the concentration ratio of the two bacteria was 1:1, pH value was 6.512 and the adding amount of fructooligosaccharides was 1.499%, the two bacteria has good microecological relationship in mixed culture system.3. Study on yield rate of viable B.adolescentis and L.acidophilusIn order to ascertain the best yield rate of viable two bacteria, we took centrifugal time and centrifugal rate as the factors, using four factors and three levels orthogonal experimental design. The results shows that we can get the best highest yield rate 83.1% under the conditions of 4DC, 30min, 6000r/min.4. New product development of B.adolescentis and L. acidophilusCompound two bacteria and Prebiotics, prepare synbiotics microcapsules, hard capsule and liquid preparation with different methods. Then took the capsules and preparation to do the following test, such as, acid resistant test, intestinal disintegration test and combined human gastric and intestinal juice effects test. The results shows that under the same condition, the survival rate of synbiotics microcapsules is higher than both hard capsule and the liquid formulations, and the survival rate can reach up to 70.8% after being artificial gastric juice for 2h, it could also get full degradation in artificial intestinal juice after 50 min, its dissolution rate is 96.7%, its survival rate was still can up to 66.8% after being combined artificial gastric and intestinal juice effect.KEY WORDS: B. adolescentis, L.acidophilu, response surface analysis, Synbiotics, MicrocapsulesDissertation Type： Research of Basic ApplicationIV目 录第 1章 绪 论 .11.1益 生 菌 概 论 .11.1.1益 生 菌 介 绍 .11.1.2益 生 菌 的 益 生 机 理 .21.1.3益 生 菌 的 生 理 功 能 .31.1.4益 生 菌 的 应 用 .31.1.5目 前 国 内 外 益 生 菌 的 研 究 热 点 .51.2益 生 元 概 论 .51.2.1益 生 元 的 概 念 与 种 类 .61.2.2益 生 元 的 健 康 效 应 .61.3微 生 物 微 胶 囊 技 术 概 论 .71.3.1微 生 物 微 胶 囊 的 制 备 方 法 及 特 点 .81.3.2微 生 物 微 胶 囊 形 成 的 影 响 因 素 .81.4立 题 意 义 和 研 究 内 容 .91.4.1立 题 意 义 .91.4.2研 究 的 主 要 内 容 .9第2章青春双歧杆菌与嗜酸乳杆菌单独培养生长条件的研究112.1材 料 .112.1.1 菌 种 .112.1.2试 验 所 用 主 要 试 剂 药 品 .112.1.3主 要 仪 器 与 设 备 .122.2 方 法 .122.2.1培 养 基 的 配 制 .122.2.2青 春 双 歧 杆 菌 与 嗜 酸 乳 杆 菌 菌 种 的 活 化 与 扩 大 培 养 .132.2.3活 菌 数 的 测 定 方 法 .132.2.4青 春 双 歧 杆 菌 生 长 曲 线 及 pH值 变 化 曲 线 的 测 定 .132.2.5嗜 酸 乳 杆 菌 生 长 曲 线 及 pH值 变 化 曲 线 的 测 定 .132.2.6培 养 基 的 筛 选 .132.2.7碳 源 的 优 化 .142.2.8氮 源 的 优 化 .14V2.2.9益 生 元 （ 低 聚 糖 ） 的 优 化 .142.3结 果 与 分 析 .152.3.1青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 生 长 曲 线 及 pH值 变 化 曲 线 的 测 定 .152.3.2培 养 基 的 筛 选 .162.3.3碳 源 的 优 化 .182.3.4氮 源 的 优 化 .192.3.5益 生 元 （ 低 聚 糖 ） 的 优 化 .212.4小 结 .23第3章青春双歧杆菌与嗜酸乳杆菌混合培养生长条件的研究 .243.1材 料 .243.1.1 菌 种 .243.1.2试 验 所 用 主 要 试 剂 药 品 .243.1.3主 要 仪 器 与 设 备 .253.2试 验 方 法 .253.2.1培 养 基 的 配 置 .253.2.2培 养 条 件 .253.2.3计 数 方 法 .253.2.4青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 在 单 独 培 养 及 混 合 培 养 时 的 生 长 情 况 与pH 值 的 变 化 .263.2.5益 生 元 不 同 添 加 量 对 青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 混 合 培 养 的 影 响 .263.2.6不 同 pH值 对 青 春 双 歧 杆 菌 、 嗜 酸 乳 杆 菌 混 合 培 养 的 影 响 .273.2.7响 应 面 分 析 法 优 化 青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 混 合 培 养 条 件 .273.2.8数 据 处 理 .273.3结 果 与 分 析 .273.3.1青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 在 单 独 培 养 及 混 合 培 养 时 的 生 长 情 况 与pH值 的 变 化 .283.3.2益 生 元 不 同 添 加 量 对 青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 混 合 培 养 的 影 响 .293.3.3不 同 pH值 对 青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 混 合 培 养 的 影 响 .293.3.4响 应 面 分 析 法 优 化 青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 混 合 培 养 条 件 .303.4小 结 .33第4章青春双歧杆菌与嗜酸乳杆菌最大活菌得率的研究 .344.1材 料 .34VI4.1.1 菌 种 .344.1.2试 剂 .344.1.3试 验 仪 器 .344.1.4培 养 基 .354.2试 验 方 法 .354.2.1离 心 速 度 、 离 心 时 间 对 青 春 双 歧 杆 菌 和 嗜 酸 乳 杆 菌 混 合 菌 液 活 菌 得 率的 影 响 .354.2.2正 交 试 验 .354.2.3活 菌 计 数 法 及 活 菌 得 率 的 计 算 .364.3结 果 与 分 析 .364.3.1离 心 速 度 、 离 心 时 间 对 混 合 菌 活 菌 得 率 的 影 响 .364.3.2正 交 试 验 结 果 分 析 .384.3.3验 证 试 验 结 果 .394.4小 结 .错 误 ！ 未 定 义 书 签 。第5章青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌混合菌株新产品的开发 .415.1材 料 .415.1.1 菌 种 .415.1.2试 剂 .415.1.3仪 器 .425.2试 验 方 法 .425.2.1培 养 基 及 其 他 溶 液 的 配 制 .425.2.2活 菌 计 数 .425.2.3其 它 指 标 的 测 定 .435.2.4益 生 菌 产 品 的 制 备 工 艺 .435.2.5合 生 元 微 胶 囊 的 制 备 .435.2.6合 生 元 硬 胶 囊 的 制 备 .445.2.7合 生 元 液 体 制 剂 的 制 备 .455.2.8保 护 剂 的 筛 选 .455.2.9合 生 元 微 胶 囊 在 模 拟 人 体 胃 肠 道 中 的 存 活 率 和 崩 解 试 验 .455.2.10合 生 元 微 胶 囊 、 合 生 元 硬 胶 囊 （ 冻 干 粉 ） 及 液 态 制 剂 保 质 期 试 验 .465.3结 果 与 分 析 .465.3.1合 生 元 微 胶 囊 的 包 封 率 .46VII5.3.2保 护 剂 的 筛 选 结 果 .475.3.3合 生 元 微 胶 囊 模 拟 人 体 胃 肠 道 中 的 存 活 率 和 崩 解 试 验 .475.3.4合 生 元 微 胶 囊 、 硬 胶 囊 （ 冻 干 粉 ） 及 液 态 制 剂 保 存 .495.4小 结 .50第 6章 结 论 .51参考文献 .52致 谢 .57攻读硕士学位期间的研究成果 .58VIII第1 章绪论1.1益生菌概论国 际 营 养 学 界 较 普 遍 认 定 ： “益 生 菌 ”（ Probiotic)是 指 一 类 对 人 体 有 益 的 细 菌 （ 或 微 生 物 ） ， 它 们 可 直 接 作 为 食 品 添 加 剂 服 用 以 维 持 肠 道 菌 群 的 平 衡 。根 据 我 国 卫 生 部 2001年 84号 文 件 附 件 (4)一 一 益 生 菌 类 保 健 食 品 评 审 规 定 1 中 指 出 ： 益 生 菌 类 保 健 品 是 指 能 够 促 进 肠 内 菌 群 生 态 平 衡 ，