胚胎工程ppt课件

胚胎工程1胚胎工程（ embryo technology） 是指 对动 物早期胚胎或配子 进 行工程技 术 操作， 获 得所需要的成体动 物的技 术 。胚胎工程技术主要包括 体外受精 、 胚胎移植 、 胚胎分割与融合 、 胚胎与精子或卵子冷冻保存 、 胚胎性别控制 、 胚胎细胞核移植 、 基因导入 等。2第一节 体外受精动物（试管动物）体外受精（ in vitro fertilization， IVF）， 是指将哺乳 动 物的精子和卵子在体外人工控制的 环 境中完成受精 过程的技 术 。体外受精 动 物也称 试 管 动 物（ test-tube animal）， 是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎 发 育到一定 阶 段通 过 胚胎移植移入受体完成 发 育出生的 动 物。体外受精动物在发挥优良母畜的繁殖潜力、促进家畜改良的速度、保存遗传资源等方面具有重要意义 。 3体外受精动物培育一般经过以下几个步骤：1. 精子采集与体外 获 能、卵子采集与成熟培养2. 体外受精3. 重 组 胚激活与体外培养4. 胚胎移植5. 体内 发 育出生4一、精子采集与体外获能精子的 选择 常采用 “ 上浮分离法 ” ：在精液中加入少量培养液，有活力的精子会游到培养液上部。 这样 收集培养液上面的精子即可得到有活力的精子。精子 获 能（ capacitation） 是指精子 获 得穿透卵子透明 带 能力的过 程 。雄性精液中含有 “去能因子 ”，附在精子表面，是 顶 体 酶 的抑制剂 ，抑制了精子的受精能力。去能因子的清除主要依靠 宫颈 、子 宫 及输 卵管液中的 淀粉 酶 ，后者在卵泡液中含量也很高。 这 些 酶 可以水解糖蛋白等 “去能因子 ”，使精子 顶 体 酶 活性恢复，具有受精能力。5最初通 过 在同种或一种雌性生殖道孵育精子 获 能，后来 发 展到用子 宫 液、卵泡液、子宫 内膜提取液或血清等再体外培养精子 获能。目前可以采用 添加 诱导 精子 获 能物 质 （如钙 离子、血清蛋白（ BSA）、肝素等）的特定培养液 来完成精子体外 获 能。6二、卵细胞回收与成熟培养用孕 酮 、雌二醇、促卵泡激素、黄体生成素、促性腺激素、前列腺素和孕 马 血清促性腺素等促 进 卵 细 胞的成熟和排卵。影响超数排卵效果的因素包括：供体年 龄 、供体品种差异、激素 剂 量、卵巢状况等。71. 成熟卵 细 胞（卵子）的收集雌性 动 物超排卵后，将腹腔 镜 插入腹腔，观 察到卵泡后用吸管吸出卵 细 胞。 这 种方法的关 键 是掌握卵 细 胞 进 入 输 卵管和卵 细 胞在输 卵管中 维 持受精能力的 时间 。 这 种方法操作程序复 杂 ，成本 较 高。由于超数排卵采集的卵 细 胞已在体内 发 育成熟，不需要成熟培养可直接受精。82. 卵母 细 胞的收集、 选择 与成熟培养（ 1）活体卵巢采集借助超声波探 测仪 、内 窥镜 或腹腔 镜 直接从活体 动物的卵巢中吸取卵母 细 胞。对 于牛和 马 等大家畜，常采用超声波探 测仪辅 助取卵，其方法是用手从直 肠 把握卵巢， 经 阴道壁穿刺插入吸卵 针 ，借助 B型超声波 图 像引 导 吸取卵泡中的卵母 细 胞。这 种手 术 方法 简单 省 时 ，操作方便，可以反复多次采集。9（ 2）屠宰后家畜卵巢采集从 刚 屠宰的母畜体内摘出卵巢，洗 涤 后保存在30-70 的无菌生理 盐 水中，快速运到 实验 室，在无菌条件下用注射器或真空 泵 抽吸卵泡中的卵母 细 胞。也可 对 卵巢 进 行切片收集卵母 细 胞。摘出卵巢 应 在 1-4h内收集。从 废 弃卵巢中采集卵母 细 胞关 键 是要注意卵巢的保温和防止微生物 污 染。10（ 3）卵母 细 胞的 选择采集到的卵母 细 胞 绝 大部分与卵丘 细 胞形成卵丘 -卵母细 胞复合体。采集的卵丘 -卵母 细 胞复合体要求卵母 细 胞形 态规则 ， 细 胞 质 均匀，外 围 由多 层 卵丘 细 胞 紧 密包围 。在家畜体外受精研究中，常把卵母 细 胞分 A、 B、 C和D四个等 级 。 A级 卵母 细 胞要求有三 层 以上卵丘 细 胞 紧 密包 围 卵母 细 胞， 细 胞 质 均匀； B级 要求卵母 细 胞 质 均匀，卵丘 细 胞 层 于三 层 或部分包 围 卵母 细 胞； C级为 没有卵丘 细 胞包 围 的裸露卵母 细 胞； D级 是死亡或退化的卵母 细胞。在体外受精中，一般只 选择 培养 A级 和 B级 卵母 细胞。 11（ 4）卵母 细 胞成熟培养对 采集的卵母 细 胞需要在体外模 拟动 物体内 环 境 进 行体外成熟培养， 获 得具有受精能力的成熟卵 细 胞。123. 体外受精精子 发 生 顶 体反 应时 ，精子 顶 体外膜与其相 贴 的卵子膜 发 生多点融合而破裂， 继 而出现 小孔。 顶 体 酶 通 过这 些小孔 释 放出去，使卵子周 围 的卵丘 细 胞分散并去除放射冠，分解透明。精子 顶 体内膜与卵 细 胞膜相互融合，最 终 雄性原核和雌性原核合二 为 一，完成受精 过 程。13（ 1）共培养体外受精一个卵子 转 至一孔或一滴受精培养液中， 对 于一些少精者可放入 2-3个卵子。每孔（滴）中加入 约 10万条活 动 精子，快速置 镜下 检查 精子 浓 度。置于 5%CO2， 37 培养箱内培养。受精 过 程所采用的培养液与 动 物 细 胞培养 类 似，但需添加一些特殊物 质 ，如肾 上腺素、 亚 牛磺酸、肝素等，它 们 有助于精子穿卵和促使原核的形成。精子 获 能 时间 、精子添加密度、精 -卵共培养 时间 、培养液 pH和离子 强 度 等 对 受精卵均有 显 著影响。通常受精后 16-20h，卵子周 围 的 颗 粒 细 胞 应 当去除，倒置 显 微 镜 下 观 察卵子内出 现 两个雌雄原核， 受精卵是否可以 发 育至囊胚是受精成功的 标 志。14（ 2） 显 微受精技 术显 微受精是通 过显 微操作 仪 将哺乳 动 物精子注入卵子，使其在体外相互结 合的技 术 。 透明 带 下注射法 用 显 微注射器将 3-5个精子直接注射入透明 带 下的卵间 隙，从而使卵子受精。 优 点是 对 卵子的 损伤 小，但是存在多精受精 问题 。 卵 浆 内精子注射法 用 显 微注射器将 单 个精子注射到卵子的 细 胞 质 内使卵子受精。避免多精受精。本方法 对 精子活力、形 态 和 顶 体反 应 没有特殊要求 透明 带 修 饰 法 人工破坏卵子的透明 带 ，使精子比 较 容易地通 过 破 损处进 入卵子完成受精。 对 于有一定运 动 能力但是 顶 体反 应 不全，无法穿 过透明 带 的精子 这 种方法比 较 适用。 优 点是 对 卵子的 损伤 小，但易造成多精受精，影响胚胎 继续发 育。154. 胚胎培养受精卵需要在体外培养 发 育至桑葚期或囊胚期才能 进 行移植。通常情况下，移植的最佳 时 期是 发 育至 8-16细 胞器的胚胎。体外受精的早期胚胎在体外 发 育中往往会停止在某一 阶段不在 发 育， 这 种 现 象称 为 发 育阻滞（ developmental block）。克服发育阻滞是胚胎体外培养的一个主要障碍，克服发育阻滞是胚胎体外培养的关键。165. 胚胎移植胚胎移植（ embryo transfer， ET） 是指将 发 育到一定阶 段的胚胎移植到与供体同 时发 情排卵、但未 经 配种的 “受体 ”母畜 输 卵管或子 宫 的技 术 。胚胎移植应选择与供体发情周期同步、生殖道正常、无疾病、繁育史良好的受体，通常采用药物调控发情期的方法，来刺激或抑制动物的生理周期，从而达到动物发情的同步化。17（ 1）手 术 法小家畜采用手 术 法移植。将同期 发 情的受体 动 物仰面固定在手 术床上，全身麻醉，借助内 窥镜观 察排卵和黄体 发 育情况。腹部切口，将一 侧 卵巢上有黄体 发 育的子 宫远 端拉出，把胚胎 输 入子 宫 上1/3处 。也可先用 钝 性 针头 在要移植部位刺一个小孔，然后把吸有胚胎的胚胎移植管插入穿刺孔，小心将胚胎 输 入。 这 种方法移卵容易，卵 损伤 小，成功率高。 创 口用手 术针线缝 合，消炎并肌肉注射抗菌素。（ 2）非手 术 法对 于牛 马 等大家畜用 专 用 输 胚 枪 直接插入子 宫 角内注入胚胎。18第二节 试管婴儿试 管 婴 儿（ test-tube baby） 是指卵子与精子在体外受精，培养 发 育成早期胚胎，再植回受体子宫 内 发 育出生的 婴 儿。1978年，世界首例 试 管 婴 儿路易斯 布朗在英国 诞 生。1983年，澳大利 亚 培育出第一例人 类 冷 冻 胚胎 试 管 婴儿。1988年，我国首例常 规试 管 婴 儿在北京医科大学 诞生。2000年，我国首例超快速冷 冻 胚胎移植的 试 管 婴 儿在湖南医科大学 诞 生。2013年 10月 4日罗 伯特 爱 德 华兹 与路易斯 19一、试管婴儿的三种类型第一代： 模 拟 体内受精 过 程，将精子和卵子通 过 共培养完成受精。 主要适用于女性原因不育（ 输 卵管堵塞、 宫颈 粘 连 ）。第二代： 采用 显 微注射 仪 将 单 个精子注射 进 卵子内受精培育。 正常受精率高，多精受精率低，主要适用于男性原因引起的不孕（少精、弱精、畸形精和无精）。缺点：由于使用的是非自然 选择 的精子受精，因此可能将 遗传 缺陷 传给 下一代，同时显 微授精操作容易造成卵子受 伤 。第三代： 经过 种植前 遗传 学 诊 断再 进 行培育。20二、试管婴儿培育技术（一）超排卵、取卵与成熟培养（二）精液采集与精子体外 获 能 处 理（三）体外受精（四）受精卵体外培养（五）胚胎移植（六）子 宫 内 发 育出生21（一）超排卵、取卵与成熟培养1. 人工使用 药 物 诱发 超排卵常用药物有氯底酚胺枸缘酸盐、枸橼酸克罗米芬（ CC）、人绝经期促性腺激素（ hMG）和人绒毛膜促性腺激素（ hCG）2. 取卵早期采用开腹取卵； 20世纪 70年代腹腔镜下取卵； 20世纪 80年代借助超声波监视直接由腹部皮肤穿入腹腔，经膀胱到达卵巢取卵；现在采用超声装置和穿刺针结合为一体的阴道探头取卵。3. 成熟培养培养时间视卵母细胞成熟情况而定22（二）精子采集与获能处理收集精液，培养液 50min孵育，使精子具有在体外与卵子 结 合的能力23（三）体外受精将体外 获 能的精子 悬 液 2-3滴（含活 动 精子 5w-10w个）滴入具有成熟卵 细 胞的 试 管内或特制的培养盒中 37 下共培养受精。精子通 过顶 替作用喜 欢过 透明 带 与卵子 结合。精卵 结 合后精原核及卵原核 发 育， 进 行 DNA复制，而后原核膜破裂，精卵染色体凝集。染色体凝集 标 志着受精 过 程完成，受精 过 程一完成，受精卵开始第一次卵裂。可在 显 微 镜 下 观 察受精情况。若精子 质 量太差，无法自然受精，采用 显 微注射法 辅 助受精。24（四）胚胎培养（受精卵体外培养）在适宜条件下培养。在体外受精 30h左右，第一次卵裂成 2cell胚卵； 40h左右，第二次卵裂成 4cell胚卵； 48h后，胚卵一般 处 于 4-8cell阶 段， 85h后， 发育至 16cell期， 120h后， 发 育至早期胚囊。25（五）胚胎移植选择约 8cell阶 段的排卵 进 行胚胎移植。胚胎移植 时 ，先将移植导 管牢固地接到注射 针 管上，洗 涤 后吸入含有胚胎的移植液。受体取卧位，在超声波引 导 下插入 导 管于 宫 腔中，注入胚胎移植液，静置 60s后慢慢拔出 导 管。受体卧床 24h，限制活 动 3-4d，同 时接受黄体 酮 等孕激素助孕，于 10d后 进 行早期妊娠 检查 。如果确定妊娠， 则 改用 hCG继续补 充到 怀 孕 10周。妊娠后 14d， B超 检查 （六）子 宫 内 发 育出生（六）子宫内发育出生26第三节 核移植动物（克隆动物）细 胞核移植（ cell nuclear transfer） 是利用 显 微操作技 术 将一种 动 物的 细 胞核移入同种或异种 动 物的去核成熟卵 细 胞内的技 术 。细 胞核移植 动 物又称克隆 动 物（ cloned animal），是用特定 发 育 阶 段的核供体及相 应 的核受体（去核的成熟卵 细 胞）体外构建重 组 胚，通 过 胚胎移植到受体完成发 育出生的 动 物克隆动物为核质杂种，包括胚胎细胞克隆动物、体细胞克隆动物 27一、克隆动物培育流程（一）核供体 细 胞 获 得与取核（二）受体 细 胞去核（三） 细 胞核移植（四）重 组 胚激活（五）重 组 胚培养和移植28（一）核供体细胞获得与取核供核 细 胞可以是 原代 细 胞或 传 代 细 胞 ，从来源上包括 胚胎 细胞、胚胎干 细 胞和体 细 胞 。分离制 备单 个 动 物 细 胞，通常采用 处 于 G0期 细 胞 作 为 核移植的供体。 G0期 细 胞又称 为 Q细 胞、静止 细 胞、休止 细 胞。 G0期细 胞从生 长 方面看是 处 于静止状 态 ，在适宜的刺激下， 细 胞能被触 发 ，从静止状 态