专题三课题2月季的花药培养绝对经典

课题 2 月季的花药培养单倍体育种花药ABAbaBab离体培养二倍体植物 AaBb单倍体幼苗ABAbaBab秋水仙素 纯合二倍体AABBAabbaaBBaabb特点：明显缩短育种年限花药离体培养：花药 单倍体幼苗单倍体育种：花药 单倍体幼苗 纯合二倍体花丝花药： 囊状结构，内有很多花粉雄蕊一、被子植物的花粉发育被子植物花粉的发育过程四分体时期 单核居中期 单核靠边期 双核期减数分裂四分体时期有丝分裂营养细胞2个精子有丝分裂花粉母 细胞（小孢子母细胞）4个小孢子减数分裂 1个小孢子花粉粒（双核）有丝分裂 花粉管细胞核 营养细胞生殖细胞核 2个精子1小孢子母细胞 4小孢子花粉囊花药4花粉粒（双核期）成熟花粉8个精子花粉 是小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，因此， 花粉是单倍体的生殖细胞。1花花粉母粉母细胞细胞4个小个小孢子孢子减分减分 有分有分 4个花粉管细胞核个花粉管细胞核4个生殖细胞核个生殖细胞核有分有分8个精子个精子花粉的发育要经历： 四分体时期、单核期、双核期（二）产生花粉植株的两种途径（二）产生花粉植株的两种途径移栽花药中的花粉 胚状体脱分化 愈伤组织 花药中的花粉 脱分化 分化 丛芽 再分化 丛芽 诱导生根体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与 合子发育成的胚非常相似的结构 ，发育过程亦与合子胚类似这两种途径之间没有绝对的界限， 主要取决于培养基中激素的种类及浓度配比。胚状体 在组织培养过程中，某些细胞在形态上转变为与 合子发育成的胚 非常相似的结构 ，发育 过程 亦与合子胚类似；神奇的人工种子:通过 胚状体 途径形成小植株烟草花药培养胚状体发育途径愈伤组织转接种到再生培养基 愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药胚状体： 离体培养的某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，胚芽，胚轴，胚根等结构完整，就像一颗种子，这种结构叫体细胞胚，或胚状体。愈伤组织： 离体的组织细胞经过细胞分裂，形成的排列疏松无规则，高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。直接影响。 选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。重要因素。因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。有某一个时期对离体刺激敏感。选材是否成功是花药培养成功的关键选材是否成功是花药培养成功的关键。 选材选材三、影响花药培养的因素三、影响花药培养的因素一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为适合花药培养的小孢子发育时期为 单核靠边期单核靠边期。选择单核期以前的花药接种，选择单核期以前的花药接种， 质地幼嫩，极易质地幼嫩，极易破碎破碎 ；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给，又给 材料的消毒带来困难，且难以挑选到单材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药核期的花药 。 花药培养时期的选择花药培养时期的选择 其它其它 时期选择的缺点时期选择的缺点为了挑选到单核期的花药，为了挑选到单核期的花药， 通通常选择完全未开放的花蕾。常选择完全未开放的花蕾。 盛盛开的或略微开放的花，都不宜开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。选作实验材料。 选择完全未开放花蕾的选择完全未开放花蕾的原因原因 完全未开放的花蕾，可挑完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少选到单核期的花药，菌少、易消毒、易消毒 单核期花药的挑选单核期花药的挑选 为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。 花药培养时间花药培养时间一般月季的花药培养时间选在一般月季的花药培养时间选在 5月初到月初到 5月的中月的中旬，即旬，即 月季的初花期月季的初花期 。初花期的花蕾营养状态。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功率。率。2、培养基的组成（ MS培养基 +不同比例的植物生长调节激素）（一）材料选取从花药看 ：月季的初花期从花粉看： 单核期从花蕾看 ：完全未开放的四、实验操作四、实验操作1.我们怎样选择想要的花粉呢？镜检方法： 醋酸洋红法 (将染色体染成红色 )焙花青 -铬矾法 (花粉细胞核染成蓝黑色 )。花药（载玻片上） 1%的醋酸洋红 1滴 用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片 镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）花药（在卡诺氏固定液中处理 20min） 取出，置于载玻片上 焙花青铬矾溶液染色 盖上盖玻片 镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）2.我们怎样保证所选的材料处于单核期？（一）材料选取2、通过 镜检 来确定是否处于适宜的发育期 。方法： 醋酸洋红法 (将染色体染成红色 )焙花青 -铬矾法 (花粉细胞核染成蓝黑色 )。1、 从花药看 ：月季的初花期从花粉看： 单核期从花蕾看 ：完全未开放的四、实验操作四、实验操作（二）材料的消毒5、无菌水冲洗 3 5次花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用 体积分数为 70%的酒精 浸泡 30秒2、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4、放入 质量分数为 0.1%的氯化汞 溶液中 2 4分钟 （ 质量分数为 1%的 次氯酸钙溶液 或饱和漂白粉溶液 ）在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药 要彻底去除花丝，要彻底去除花丝， 因为与花丝相连的花药因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。不利于愈伤组织或胚状体的形成。立即将花药接种于培养基上，通常每瓶立即将花药接种于培养基上，通常每瓶 接种花接种花药药 7-10个个 。1、剥取花药、剥取花药 勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。生愈伤组织。2、接种、接种注意：注意：（三）接种和培养（三）接种和培养 培养条件：温度控制在培养条件：温度控制在 25 左右，不需要左右，不需要光照。光照。 幼小植株形成后才需要光照。幼小植株形成后才需要光照。 3、培养、培养 培养：一般经过培养：一般经过 20-30天培养后，会发现花药天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。基上，以便进一步分化出再生植株。 注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，花药内就会产生大量幼小植株， 必须在花药开必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，裂后尽快将幼小植株分开， 分别移植到新的培分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。养基上，否则这些植株将很难分开。在花药培养中，特别是通过愈伤组在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是色体倍性的变化（主要原因是 营养营养细胞核和生殖细胞核融合细胞核和生殖细胞核融合 造成的）造成的）。4、鉴定和筛选、鉴定和筛选课题成果评价选材是否恰当选材是否恰当选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会 通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。无菌技术是否过关无菌技术是否过关如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如 培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。接种是否成功如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株