微生物检验与临床

2010.5,阮斐怡,微生物检验与临床,微生物实验室设立目的,协助临床医生诊断及治疗感染症。检验结果提供抗生素治疗依据。提供流行病学数据供医院感染管制措 施参考。,微生物实验室功能,检查及培养临床标本中的微生物。正确鉴定临床上有意义的分离菌株。对有意义的分离菌株进行药敏试验。提供快速正确的检验报告。,成功分离病原菌标本收集、运送、保存标本处理方法医务人员专业知识正确判读微生物培养报告选择适当治疗方法,成功治疗感染症因素,临床检验科全面质量管理系统,全部检验流程中各分析阶段实验室检验错误,理解检验的需求性检验申请的必要条件 32-75% 病人准备 分析前标本采集标本处理4-32% 标本分析 分析中报告单的生成 9-55% 报告单修正 分析后报告判读Clin.Lab.Med 3:541-551,1983Clinical Chenistry 48:5,691-698,2002,提供最佳的微生物病原菌发现率，使污染率降至最低及培养结果容易判读。提升实验室工作效率及病患照顾质量。降低医疗成本。,良好的微生物送检标本,微生物实验室分析前处理流程图,检测项目一览表,标本采集部位,分析前,标本采集 标本接收 标本拒收 标本储存,标本收集与运送原则,收集急性期真正病灶处的标本，不得受到邻近区域微生物的污染 采用无菌器材收集标本，并装于坚固、密封的无菌器材中 收集“足量”的标本 在病人使用抗生素或伤口局部治疗前收集标本,注意生物安全,采集：采取标准防护措施 运送：不可造成标本外漏及容器破损并迅速送到实验室 储存及操作：避免标本中污染菌生长并保持病原菌活性,标本采集,尿道、会阴部,穿刺部位,口腔、呼吸道,皮肤、黏膜,污染！,标本采集,1. 选择正确的解剖部位。下表列出了一些几乎为临床提供不了什么有用信息的标本。,2. 选择合适的部位采集用于厌氧菌培养的标本，见下表。活检 或针头抽吸物是最佳的选择，一般不要用厌氧菌拭子标本。决不要把厌氧菌培养的标本冷藏，相反，要在室温下保存。,标本采集,微生物标本接受或拒绝标准及处理方式,血培养标本,1. 血培养瓶适用的标本 血液、骨髓、脑脊液、胸腹水、关节液、腹透液等无菌体液。2. 血培养次数对怀疑菌血症的成人患者，上海市院感办建议在不同部位采集2瓶需氧瓶或2套（1套为一瓶需氧和一瓶厌氧）血培养标本。 研究证明：血培养只做一套的阳性检出率为65%，做2套和3套检出率分别为80%和90%。,3. 采血量 成人患者建议5-10ml/瓶。 婴幼儿患者建议每瓶不少于2ml。4. 采血时机 抗菌药物使用之前。 寒战出现时至发热初期采集血培养最佳。 5. 血标本在需氧和厌氧瓶中的分配 推荐以一个需氧瓶和一个厌氧瓶作为常规血培养的组合。 当采血量不能满足推荐采血量时，应首先满足需氧瓶的需要。,分析前血培养标本,血培养标本,6. 影响血培养采样因素采样人员技术 采集部位 穿刺部位消毒工作 采样数量与时机选择,血培养标本,7. 特殊的全身性和局部感染患者采血培养的建议急性高烧：10min内，由不同部位抽取2套标本。 非急性高烧疾病：24h内，由不同部位抽取2-3套标本，每套间隔3h 。 急性心内膜炎：在12h内不同部位采集3套血标本，如果24h后阴性，再采集3套以上的血标本。 亚急性心内膜炎：24h内从3个不同部位采3套，每套间隔15min，如24h内为阴性，要再采2-3套。 急性脓毒病：10min内从不同的部位采23套。 可疑急性原发性菌血症、脑膜炎、骨髓炎、关节炎或肺炎。应在不同部位采集23套血标本。 不明原因发热，如隐性脓肿、伤寒热和波浪热，从不同体位采集23套，间隔1h，如24h内为阴性，需再采2-3套。,8. 皮肤消毒血培养瓶口应以75%酒精的消毒剂处理。 彻底消毒皮肤，并用75%酒精由内往外的方向涂抹去除碘酒液，以避免碘酒污染血培养液。,血培养标本,血培养容器,需氧血培养瓶,厌氧血培养瓶,血培养瓶应室温放置，不要放入冰箱冷藏。,血培养容器,中和抗生素血培养瓶,真菌/分枝杆菌血培养瓶,血培养瓶应室温放置，不要放入冰箱冷藏。,1. 血管导管及腹膜透析导管培养是监测血流感染源方法之一。 2. 标准方法：由导管抽取20ml血液，进行血培养；导管周围的皮肤消毒，然后以无菌剪刀取下约5公分长度导管尖，置于无菌容器中送检；再由另一处静脉端抽血进行血培养。 3. 实验室将导管尖于培养基上滚动数次后进行培养，如果菌落数15CFU/TiP以上，则认为血流感染是可能与导管有关。,血管导管培养,4. 导管尖于培养基上滚动数次后进行培养，如果菌落数15CFU，可能有意义分离菌：白色念珠菌金黄色葡萄球菌A群链球菌革兰氏阴性杆菌5. 导管血培养阳性时间较静脉血培养早二小时，可能为导管引起的血流感染。,血管导管培养,尿液标本,1. 收集方法中段尿无菌导尿管收集耻骨上方穿刺抽取2. 标本收集后若无法立即送检应置于冰箱（4-8）待送，4 保存不可超过6小时。,尿液标本,1. 培养18-24h观察平板上菌落情况，连续两天无细菌生长，报告“培养两天无细菌生长”。2. 若培养出三种以上细菌，标本可能污染，建议重新送检。3. 尿液中发现任何细菌，并不一定表示尿路感染。一般而言，菌落计数在105/ml以上代表真正感染； 104105/ml感染可能；2种视为污染； 若病人已服抗生素， 104 /ml也可能是感染。,1. 收集标本中粘液或血液的部分2. 使用转运培养基或无菌容器运送,粪便标本,粪便标本容器,标本量大,标本量小,伤口、组织、厌氧标本,1. 厌氧培养标本，应采集后15-30min内转运，避免长时间暴露空气中。厌氧菌标本不可冷藏。 2. 脓肿与疖最好以针筒直接由病灶处抽取。 3. 清除伤口表面坏死组织，采集深层部位标本。 4. 组织标本应放置于无菌容器中，在容器中放置少量生理盐水防止标本干枯。,量少时,伤口、脓液送检方法,5. 选择合适部位采集用于厌氧菌培养的标本见下表。,伤口、组织、厌氧标本,痰标本,1. 标本收集前，须先用温开水漱口刷牙。2. 收集清晨病人肺深部咳出痰液。3. 置于无菌密闭容器中运送，在2小时内 送达实验室。,1. 痰革兰染色涂片： 决定标本收集是否适当。 一般上皮细胞25个/LP（低倍镜视野），认为此标本受口腔污染，培养结果仅供参考。,合格痰判断标准,1. 脑脊液、胸腹水、关节腔液等无菌体液应无菌收集。 2. 最好2ml以上。 3. 无菌体液应做厌氧培养。 4. 脑脊液、生殖道、眼、耳标本不要冷藏。 5. 迅速将标本送至实验室。,其它标本,分枝杆菌培养抗酸涂片,1. 痰液（培养及抗酸涂片）指导病人于清晨以温开水刷牙漱口。肺深部咳出痰液最佳，量多为宜。痰液分别收集3次标本。（一天内）2. 尿液分枝杆菌培养：留取清洁中段尿。抗酸涂片：留取24h尿或全夜尿，静止2小时弃上清留取沉渣送检。3. 脑脊液（培养及抗酸涂片）需要2ml以上。,诊断肺结核及分枝杆菌培养结果比较,阳性率比较,建议：抗酸涂片及分枝杆菌培养应同时送检以提高阳性率。,标本的转运和储存,所有标本必须立即送交实验室，必须在2h内。 厌氧培养的临床标本，适宜的转运首先取决于所获标本的体积。标本应于采集后15-30min内转运，厌氧培养标本应避免过长时间暴露于空气中。 对环境敏感的微生物包括志贺菌、淋球菌、脑膜炎双球菌和流感嗜血杆菌（对低温敏感）。所以对脑脊液、生殖道、眼或内耳标本不要冷冻。,标本的转运和储存,血培养瓶不论是在接种标本前或后都应室温放置，不要放入冰箱冷藏。 将临床标本或感染性物质转运到实验室，不管距离如何，转运的标本必须正确地标记、包装，在转运过程中应以密闭运输箱运送。返回2,细菌培养标本接种须知,培养基的质控,外观检查 无菌试验 生长试验及生化试验,培养基质控必须的基本条件,要求实验室保存参考菌种； 实验前和实验时检验培养基质量； 清晰记录质控实验非常重要； 必须有一份NCCLS M-22-A3（商品微生物培养基质量保证指南）作为参考工具书 。,试剂质控,表1常用试验试剂质量控制,触酶,葡萄球菌属微球菌属,链球菌属肠球菌属,G+球菌,革兰涂片,阳性,阴性,七叶苷阳性、 6.5Nacl阳性,肠球菌属,链球菌属,需氧革兰阳性球菌鉴定流程图,中等大小、黄或灰白、溶血或不溶血的菌落,小、黄色菌落,报微球菌属,金黄色葡萄球菌,呋喃唑酮 葡萄糖发酵,上机,+,试管血浆凝固酶,葡萄球菌微球菌属,24h溶血,+,G+球菌,触酶,+,葡萄球菌、微球菌鉴定流程图,G+球菌,触酶,A群链球菌,杆菌肽,CAMP,BAP溶血,其他检测,疑 问,敏 感,阳 性,B群链球菌,其他检测,七叶苷：或 6.5Nacl：,链球菌鉴定流程图,上机,可能屎肠球菌,可能粪肠球菌,阿拉伯糖：-； 山梨醇：+,阿拉伯糖：+； 山梨醇：-,肠球菌鉴定流程图,G-杆菌,氧化酶,+,产绿色素，有生姜味，溶血,双糖-/-、42生长+,可能绿脓杆菌,上机,Yes,Yes,No,No,肠杆菌科,+,IMVIC,+,可能大肠埃希菌,双糖:A/A H2S: 动力:+ 尿素:,上机,Yes,No,结合菌落特征：中国蓝上呈深蓝色菌落,Yes,双糖：A/ A 动力：- I： - 鸟氨酸：- 赖氨酸：+,结合菌落特征：大而厚实、光亮、凸起、灰白色粘液型菌落，可挑出粘液丝,可能肺炎克雷伯菌,No,需氧革兰阴性杆菌鉴定流程图,嗜血杆菌,痰标本疑似菌,其他标本疑似菌,上机,上机,菌落特征：BAP不生长；巧克力培养基上呈小至中等、无色、半透明灰色菌落，粘性且有鼠臭味,副流感嗜血杆菌,流感嗜血杆菌,X因子- V因子- XV因子+,X因子- V因子+ XV因子+,No,Yes,Yes,No,嗜血杆菌鉴定流程图,在TCBS平板上见扁平、深绿色、粘有辛辣味的菌落,氧化酶：+,Yes,0%Nacl：； 4% Nacl：+ 8%Nacl：+；10% Nacl：付溶定位：红色,No,Yes,No,可能副溶血弧菌,上机,转种血平板,副溶血弧菌鉴定流程图,在TCBS平板上见扁平黄色菌落,可能是霍乱，溶藻,进一步鉴定+血清凝集等,革兰染色着色不均,念珠菌定位平板,绿色,镜下圆形、卵圆形折光性较强孢子,白色念珠菌、 都柏林念珠菌,粉红色,可能克柔念珠菌,可能热带念珠菌,蓝灰色,紫色,白色,可能光滑念珠菌,酵母菌属,上机,无菌体液（血、csf、胸腹水等）,念珠菌属鉴定流程图,芽管实验+,念珠菌定位平板应用,常见革兰氏阴性杆菌的生化反应（氧化酶阴性）,d:表示不定,厌氧标本的接种,厌氧标本的接种： 化脓性感染标本或穿刺液等：将标本涂布于厌氧血平板、LBK平板等培养基第一区，四区划线接种后，立即置于含厌氧发生袋、厌氧指示剂的厌氧罐中35厌氧培养。 此外，将标本涂布玻片，待干燥后，进行革兰染色显微镜检。,厌氧菌鉴定,孵育48-72小时后检测所有培养平板。 记录生长的每一种菌的形态，描述包括：大小、形状、混浊、色素、凹陷、溶血情况。 对每一种生长的菌落进行耐氧试验：挑取单个菌落，分别接种到巧克力平板、血琼脂平板和厌氧血平板。巧克力平板和血琼脂平板放置355%CO2环境，厌氧血平板放置35厌氧环境下培养。若巧克力平板和血琼脂平板48小时孵育后无生长，厌氧血平板48小时孵育后生长，为专性厌氧菌。 将耐氧试验中挑出的厌氧菌进行革兰染色 选择相应的鉴定系统进行鉴定。,肠杆菌科： 当试验粪便中分离的沙门菌和志贺菌株时，只有氨苄西林、喹诺酮和TMP/SMZ可用于常规试验报告。另外，对沙门菌属的肠道外感染分离株，应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素。 对CSF分离株，头孢噻肟和头孢曲松将取代头孢噻吩和头孢唑啉的试验和报告。 肺炎链球菌： 对脑脊液的肺炎链球菌分离株，应该用可靠的MIC法测试并常规报告青霉素和头孢噻肟或头孢曲松或美罗培南的敏感性。对这些分离株，也应该用MIC法或纸片法测万古霉素的敏感性。对其他部位的分离株，可用苯唑西林纸片筛选试验。如抑菌环直径19mm，就应该测试青霉素和头孢噻肟或头孢曲松的MIC。 链球菌属： 对分离自血液与正常无菌部位（如脑脊液、血液、骨髓）的草绿色链球菌，应该用MIC法测试青霉素的敏感性。青霉素、氨苄西林、左氧氟沙星、氧氟沙星的纸片法解释标准 仅用于-溶血链球菌。,不同感染部位标本抗生素选用原则,CLSI/NCCLS建议核实抗菌药物敏感性试验结果和确证菌株鉴定,分析后,MRS(耐甲氧西林葡萄球菌) 主要细菌：金黄色葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌。耐药特点：MRS对头孢类和其他内酰胺酶类如阿莫西林/克拉维酸，氨苄西林/舒巴坦，替卡西林/克拉维酸，派拉西林/三唑巴坦和亚胺培南在体外可显示活性但临床应用无效。这是因为决大多数文献报告的MRS感染用内酰胺酶类疗效差，而且缺乏令人信服的临床数据证实这些药临床有效。,1.5 下列细菌的耐药特点ESBLs(超广谱内酰胺酶) （2010年已修正）产生的细菌：主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌及奇异变形杆菌产生。耐药特点：对青霉素类，头孢菌素、单环内酰胺酶类抗生素耐药，即使体外可显示活性但临床应用无效。通常对碳青霉烯类，头霉素类及酶抑制剂复合制剂敏感。嗜麦芽窄食单胞菌 对亚胺培南天然耐药。,分析后,分析后结果报告的管理,初级报告：当实验室出现临床上可能引起生命危象的检测结果、检测到传染病报告（如：志贺菌、沙门菌、霍乱弧菌、分枝杆菌等）、临床特别要求提早给予试验结果信息时、出现疑难菌株时，给予临床的一种口头报告方式，以方便临床及时采取措施。当试验获得最终结果时，必须完成正式报告。 正式报告：专用微生物检验报告，报告单上应有必需的病人信息、标本信息、检测结果、检测人员信息等。如遇特殊情况需要手写，必须经负责人签字和盖章方可生效。 所有检验报告都以统一格式电脑打印发出。,由微生物室负责人或其指定人员负责审核。 审核报告前须先阅读质控结果，只有质控结果通过才可进行审核工作。 药敏数据的审核。 警告值的核对。 罕见结果的核对：脑脊液、血培养（除凝固酶阴性的细菌外）等无菌体液、脓、伤口、厌氧菌标本出现稀有细菌时，须告知微生物室负责人，经确认后方可发出报告。形态学检查，少见的细菌形态以及细菌鉴定应由多位微生物工作人员共同讨论，只有意见达成共识方能出具报告。,分析后结果报告的管理,分枝杆菌阳性报告须经微生物室负责人或其指派人员复核方可报告，立即联系临床医师和填写传染病报告及危急值报告。鉴定出沙门菌、志贺菌、脑膜炎双球菌、霍乱弧菌等传染病细菌，应立即填写传染病报告，经微生物室负责人或其指派人员审核签字后方可报告。血培养和脑脊液、标本染色涂片发现或 培养出细菌后，应立即做危急值报告。,特殊结果的核对,取万古霉素MH平板。 加104CFU/ml菌液至MH平板上，加样最好在制备好菌悬液后15min内完成。 35孵育16-20小时。 判断结果：有无细菌生长。 细菌悬液的配制：先配制0.5McF的菌悬液，再做10稀释，点种12l。,VA-MIC接种,葡萄球菌（金葡、路邓、表葡、腐生、溶葡）肠球菌（粪肠、屎肠）链球菌（A群、B群、肺双）肠杆菌科H2S、苯丙、尿素、I、氨基酸 不动杆菌（鲍曼、洛菲）非发酵（绿脓、粪产碱、洋葱、嗜麦芽）肠道细菌鉴定卡他,对临床常见细菌的识别方法,布鲁氏菌 人心杆菌 腐蚀艾肯菌 金氏金氏菌 多杀巴斯德斯,对临床少见细菌的识别方法,定位平板,念珠菌 尿道菌定位 沙门菌 金葡菌 付溶血弧菌,临床微生物检验需要积极主动与临床沟通,一、为什么要积极主动与临床沟通？ 二、沟通些什么内容？ 三、怎样沟通？,一、为什么要积极主动与临床沟通？,1. 检验医学是一门为临床服务的学科； 2. 临床微生物检验是病原学诊断，对临床诊治非 常重要； 3. 检验医学和临床医学都在快速发展，需要检验临床双方沟通，才能做好。,二、沟通什么内容？,分析前质控程序：标本采集。分析中：微生物检验的新发展,微生物检验流程.报告要与临床沟通。,三、如何与临床沟通？,通过各种形式的学习、培训及宣传活动； 电话、咨询 课题合作 定期向临床发布细菌耐