实验二胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定

实验二 胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和活性测定（ P40）一、实验目的l（ 1）了解胰蛋白酶抑制剂的制备方法；l（ 2）了解胰蛋白酶抑制剂抑制活性测定的原理和方法；l（ 3）掌握离心机和微量移液器的使用方法。二、实验原理胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶有抑制活性的 蛋白质 。利用蛋白质可溶于水或提取液中的性质，可用水或提取液从富含胰蛋白酶抑制剂的材料中 抽提 胰蛋白酶抑制剂，利用 盐析 使胰蛋白酶抑制剂沉淀出来，得到含有胰蛋白酶抑制剂的蛋白质制品。在制备过程中通过测定对胰蛋白酶的抑制活性进行跟踪检测。二、实验原理胰蛋白酶可作用于其底物苯甲酰 -L精氨酰 -对硝基苯胺 (BAPNA)，使 BAPNA发生水解，生成苯甲酰 -L-精氨酸和淡茶色的对硝基苯胺，使溶液变成淡茶色。如果在此活性测定系统中加入过量的胰蛋白酶抑制剂，过量的抑制剂与胰蛋白酶竞争底物，抑制了胰蛋白酶的水解活性，不能使底物水解，无对硝基苯胺的生成，不能使溶液变成淡茶色，而呈现无色，从而表现出胰蛋白酶的抑制活性。本实验以大豆为主要原料，制备胰蛋白酶抑制剂，并测定其抑制活性。二、实验原理BAPNA BA p-NA三、试剂与仪器（一）试剂R 0.2 mol/L Na2HPO4， 0.2mol/L NaH 2P04。R 0.8mol/L磷酸缓冲液； 36mL 0.2mol/LNa2HP04与 14mL 0.2mol/L NaH2PO4混合，用蒸馏水定容到 500 mL。R 固体硫酸铵。R 2 mol/L HCIR l0mol/L NaOH。R 60乙酸溶液 (v/v)。R 底物缓冲液： 0.1 mmol/L pH值 8.1 Tris-HCI缓冲液 (内含 0. 4的氯化钙 )。R 1 mmol/L BAPNA水溶液 .R 20 mg/mL胰蛋白酶溶液：用 0. 001mol/L盐酸配制。三、试剂与仪器（二）材料与器材v 新鲜材料v 绞碎机v 纱布v 台式高速冷冻离心机v 微量移液器v pH值试纸v 恒温水浴锅v 电子天平v 玻璃试管、烧杯、量筒v 离心管四、实验方法（一）胰蛋白酶抑制剂的提取和纯化50g大豆，绞碎， 1： 7加水pH5.0， 4 ，过夜缓慢加入硫酸铵至 60%饱和度10ml， 2500rpm， 15min取 1.5mL上清， 10000rpm， 10min静置 0.5h弃沉淀留上清，调 pH7.0，测体积 V，计算硫酸铵量纱布过滤留沉淀，加入 200L dH2O胰蛋白酶抑制剂水溶液胰蛋白酶抑制剂水溶液（ 1）取两支试管，分别标记记号，其中 1号管为对照管， 2号管为测试管。（ 2）按照 (表 2-1)表格所示数据将溶液分别加入两支试管中。（ 3）将试管中的溶液摇匀，放入 28 水浴 2 min。（ 4）向两支试管中各加入 0.2 mL 20 mg mL的胰蛋白酶溶液，摇匀。（ 5） 28 水浴 5 min。（ 6）向两支试管中分别加入 0.4 mL 60的乙酸。观察现象。四、实验方法（二）胰蛋白酶抑制剂的活性测定