凝固酶阴性葡萄球菌

凝固酶阴性葡萄球菌致病性分子标志物的建立与应用姜美娟姜美娟中国人民解放军第中国人民解放军第 401医院医院 11、立题依据u 凝固酶阴性葡萄球菌（ CoNS）广泛存在于人体皮肤、黏膜等组织表面，常在血液、痰液、尿液、深静脉置管等各种标本中检出。文献报道， 1995-1996年美国 48个医学中心 2596份血标本中， CoNS的分离率达 32.2% 。尽管血液等无菌体液培养出 CoNS临床意义较大，但据报道单次血培养 CoNS污染的可能性仍高达 85%。第一部分 研究背景和意义2u 近年来由于介入性诊疗操作、免疫抑制剂及广谱抗生素的广泛使用， CoNS已成为院内感染的重要病原菌，而且耐药菌株比金黄色葡萄球菌更为多见。叶联华等报道人工瓣膜术后心内膜炎中，约有 40%-50% 由凝固酶阴性葡萄球菌引起；2009年中国 CHINET细菌耐药监测结果 MRCoNS检出率平均为 71.7%, 大于 MRSA的 52.7% 。研究背景和意义3u CoNS 作为皮肤黏膜定植菌，在越来越多的标本中被分离出来，常常引起临床困惑。其是否能作为感染的病原菌是临床关心的问题。u 有鉴于此， 实验室建立对 CoNS污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是临床明确诊断和制定合理治疗方案的重要前提 。研究背景和意义4CoNS致病物 质u 在 CoNS 感染的发病过程中，细菌先黏附继而形成难以清除的生物膜是其最为重要的致病机制 ；u 其中 CoNS产生的 多糖胞间黏附素（ polysacchatide intercellular adhesion， PIA） 是细菌生物膜形成聚集阶段所必需的物质，在感染过程中起重要的作用，是鉴定其致病性的物质基础。u Heilmann 等发现 ica 操纵子 对合成 PIA 以及在细菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。 研究背景和意义5ica 基因结构u ica 基因座定位于细菌染色体，全长 3.4 kb，包括 icaR 调节基因及串联存在的 icaA、 icaD、 icaB 和 icaC 结构基因。其中， icaADBC 4 个基因构成一个操纵子，可以通过检测 icaADBC 基因来反映 ica 操纵子的存在。icaB 不直接参与胞间黏附素的合成 ,因为重组 icaADC 就能使细胞积聚； icaA 单独呈现低的 N-乙酰葡糖胺转移酶活性； icaC涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞表面；生物膜的形成要求 icaD编码的产物具有最佳活性。因此 ,我们选择了 icaD 作为本试验的目的基因片段。研究背景和意义6u 获得 CoNS特异的致病性分子标志物；u 确立敏感、准确、快速的医院感染相关性CoNS特异基因诊断方法；u 能够准确鉴定致病性与非致病性 CoNS。研究背景和意义2、实验目的 7研究 CoNS的生物标志物对该菌在医院获得性感染中的临床微生物学诊断与鉴定，追踪传染源，探索其在医院感染中的确切作用和地位、传播与感染规律，从而对控制传播途径、建立准确有效的防治措施具有重要实际意义和经济价值。研究背景和意义3、临床意义8u 阴性对照：表皮葡萄球菌 ATCC12228，购自中国药品鉴定所，经基因组测序证明其 ica操纵子缺失 ；u 阳性对照：表皮葡萄球菌 1-97-337，瑞金医院倪语星教授惠赠，含有完整 ica操纵子；u 待测样本：自 2006年 1月至 2007年 9月，收集我院临床各科室共 114例疑是感染性标本。第二部分 材料和方法1、研究对象92、主要试剂u 培养基： 哥伦比亚琼脂培养基、 刚果红琼脂 培养基、 LB肉汤增菌液。u 引物：SodA引物（ 5-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3 及5-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3）；icaD引物（ 5-AGGCAATA TCCAACGGTAA-3及5-GTCACGACCTTTCTTATATT-3）；16S rDNA 引物（ 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3及5-CCGTCAATTCCATTTRAG TTT-3）。 材料和方法103、主要仪器设备u PCR仪： PTC100 PCR仪，美国 MJ Research Inc.；u 恒压恒流电泳仪、电泳槽： DF-C型，北京东方特力科贸中心；u 凝胶成像系统： GDS8000 ，美国 UVP Inc.； u 核酸 /蛋白定量仪： DU640，美国 Beckman；u 酶标仪：美国雷杜，深圳组装；u ATB Expression：法国 bioMrieux Inc；u 生物安全柜： BSC-1500 B2，济南鑫贝西生物技术有限公司；u 全自动快速微生物培养检测系统： BacT/ALERT 3D 60，法国 bioMrieux Inc；材料和方法114、实验设计及方法标本采集阴、阳性对照菌种鉴定PIA检测 PCR扩增icaD基因 sodA基因 16SrDNA序列生物膜形成实验DNA测序、生物信息学分析确定特征片段临床验证比较分析材料和方法12图图 2.1： 部分样品刚果红试验结果3 41、刚果红试验第三部分 结果和讨论13表 2.1: 114例 CoNS的菌种组成及刚果红试验结果菌 种 例数 所占比例（ ） 刚 果 红试验 阳性刚 果 红试验各菌种阳性率（）表皮葡萄球菌 47 41.2 18 38.3溶血葡萄球菌 43 37.7 3 6.98人葡萄球菌 11 9.65 1 9.09木糖葡萄球菌 3 2.63 0 沃氏葡萄球菌 2 1.75 0 头 状葡萄球菌 3 2.63 1 33.3中 间 葡萄球菌 1 0.86 1 100山羊葡萄球菌 2 1.75 0 缓 慢葡萄球菌合 计21141.75100024结果和讨论14u 刚果红试验通过培养 48h后菌落的颜色变化来反映 CoNS 表达多糖胞间黏附素的情况，进而间接地反映其致病性。u 114例样品中刚果红试验阳性率 21.1% ，由于 CoNS分泌的 PIA在培养过程中可以丢失，使阳性结果偏低；另外，其方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验结果的正确性，不能满足临床要求。结果和讨论152、 ica D基因片段的扩增 a b c d e f g20001000500250(bp)图 2.2 ：部分样品的 icaD基因片段的 PCR 扩增结果结果和讨论16表 2.2: 114例 CoNS不同菌种 icaD片段 PCR扩增的结果 菌 种 例数 所占比例（ ）icaD片段PCR阳性结 果PCR实验各菌种阳性率（）表皮葡萄球菌 47 41.2 20 42.6溶血葡萄球菌 43 37.7 8 18.6人葡萄球菌 11 9.65 2 18.2木糖葡萄球菌 3 2.63 0 沃氏葡萄球菌 2 1.75 0 头 状葡萄球菌 3 2.6 2 66.7中 间 葡萄球菌 1 0.86 1 100山羊葡萄球菌 2 1.75 0 缓 慢葡萄球菌合 计21141.75100033结果和讨论17u 通过设计 icaD基因的特异性引物，对临床分离的 114 株CoNS进行 PCR 循环扩增， 29% （ 33/114）的菌株可以检测到 357bp 的 icaD 基因产物；u 表明大部分 CoNS 不表达胞外多糖，无致病性，或者临床分离的绝大部分 CoNS 可能是低毒性，源于正常菌群的污染。u 采用 PCR 技术对 ica 操纵子结构基因片段进行扩增，可以准确、快速地鉴定 CoNS中致病性与非致病性的葡萄球菌，从而对临床凝固酶阴性葡萄球菌的正确诊断和合理治疗提供实验室依据，有重要的临床意义。结果和讨论18图 2.3 : 部分样品的定性黏附性实验结果3、体外黏附性实验结果和讨论19表 2.4 : 9例 icaD（ + ）菌株 半定量黏附性实验结果实验 分 类实验 例数 黏附 实验阳性黏附 实验阴性ica D PCR（），刚 果 红 （） 6 6 0ica D PCR（），刚 果 红 （ ） 3 2 1合 计 9 8 1结果和讨论20u 通过体外半定量黏附实验测得 88.9% （ 8/9）icaD（ + ）菌株是粘附株。u 可见以半定量黏附试验结果作为生物膜形成能力的判定标准， ica 操纵子的存在与 CoNS粘附及其生物膜形成密切相关。u 体外黏附性实验用光吸收原理检测生物膜成分，但生物膜本身的结构会受到破坏；且由于方法比较复杂，需要严格控制实验条件才能获得较好的重复性，不适合临床常规应用。结果和讨论214、 16S rDNA及 sodA基因片段扩增a b c d e 20001000500100(bp)图 2.5：部分样品的 16S rDNA片段 PCR扩增结果 结果和讨论22图 2.6： 部分样品的 sodA 片段 PCR 扩增结果a b c d e 20001000500250(bp)结果和讨论23图 7： 部分样品 sodA PCR扩增产物的测序图谱结果和讨论24u 37例 CoNS样品进行了 16S rDNA基因及 sodA基因片段的 PCR扩增，电泳检测结果显示全部样品均能准确地扩增出相应的片段，其片段大小分别为 16S rDNA 926bp及 sodA 482bp，且均为单一条带；u 序列测定表明所有样品 16S rDNA 及 sod A PCR产物序列均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列。结果和讨论25u ica操纵子可出现在多种 CoNS中，临床实验室建立并常规进行 CoNS致病性分子标志物的检测方法是有意义、有必要的；u 通过本实验我们确立了的敏感、准确、快速的医院感染相关性 CoNS基因诊断新方法，即 ica D基因扩增方法；第四部分 结论26结论u 本研究首次报道了除表皮葡萄球菌以外的其他种的凝固酶阴性葡萄球菌产生多糖胞间