初始污染菌检测

初始污染菌检测* 1参考标准n 中华人民共和国药典 2005版 附录 微生物限度检查法n ISO 11737-1:2006 Sterilization of medical devices Microbiological methods Part 1: Determination of a population of microorganisms on productsn GB/T 19973.1 /ISO 11737-1:1995 医疗器械的灭菌 微生物方法 第一部分：产品上微生物总数的估计n GB 15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准Date 2检测环境及检验量n 应在环境洁净度 10000级下的局部洁净度100级的单向空气区域内进行n 一般供试品的检验量为 310个独立包装的同批次供试品。（见 ISO 11737-1:2006 A8.1）Date 3实验材料及设备n 营养琼脂培养基、 pH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液n 滤器、微孔滤膜（孔径 0.45微米，直径50mm）、量筒、剪刀、镊子、培养皿n 过滤装置、电子天平、压力蒸汽灭菌器、生化培养箱等Date 4主要步骤采样 供试液制备 培养 菌落计数Date 5供试液的制备n 用？ ml 氯化钠 -蛋白胨缓冲液浸提？小时（包括最内层包装的内壁）-所需供试液的用量和浸提时间需验证n 处理方法：振动、冲洗、擦拭法、袋蠕动、超声、涡旋混合、搅拌Date 6举例 振动n 小型医疗器械可以投入无菌的自封袋中，加入缓冲液充分振动。n 另外，用缓冲液冲洗内包装袋的内壁。并与产品缓冲液相混。Date 7梯度稀释1ml 1ml1ml 1ml1ml 1ml 1ml 1ml供试液 9mlNacl 9mlNacl1:101:1001:1000Date 8转至培养基n 膜过滤法 适用于微生物浓度较低的悬液n 平板倾注 适用于微生物浓度较高的悬液n 平板涂布 适用于微生物浓度较高的悬液n 螺旋涂布Date 9薄膜过滤法Date 10培养n 药典中的培养条件：细菌 30-35 48h霉菌、酵母菌 23-28 72h必要时，可适当延长培养时间至 5-7天Date 11菌落计数n 计数方法： 将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。n 菌落特征： 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、 淡黄色（如果培养基中加入 0.1%TTC(氯化三苯基四氮唑试剂 )， 菌落为红色） 边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。 大小差异很大。Date 12计数方法的验证 回收率n 验证试验至少应进行 3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。n A 试验组 供试液 +试验菌（ 50100cfu）n B 菌液组 试验菌（ 50100cfu）n C 供试品对照组 n D缓冲液对照组 缓冲液 +试验菌（ 50100cfu）(A-C)/B70% D/B70%Date 13菌落计数报告规则 平板法n 选取细菌、酵母菌平均菌落数在 30 300之间、霉菌平均菌落数在30100之间的稀释级作为报告菌落数的依据。1）如只有 1个稀释级平均菌落数符合上述规定，则将稀释级的菌落数乘以稀 释倍数报告。2）如有两个相邻稀释级的平均菌落数在 30 300之间，则先计算两稀释级菌落数的比值。高稀释级的平均平板菌落数 稀释倍数比值 =低稀释级的平均平板菌落数 稀释倍数当比值 2时，则以 2个稀释级的平均菌落数均值报告；当比值 2但不超过 5时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告；当比值大于 5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再进行检查，必要时，应进行方法的重新验证。3）如各稀释级平均菌落数均在 300以上，则按最高平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在 30以下，则按最低平均菌落数乘以稀释倍数报告。4）如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于 1时，以 1乘以最低稀释倍数的值报告菌数Date 14菌落计数报告规则