十六蛋白质工程和基因工程的简介

第十六章 基因工程和蛋白质工程简介第一节 DNA重组与基因工程第二节 蛋白质工程简介第三节 核酸研究技术简介返回第一节 DNA重组和基因工程基因工程亦称遗传工程，即利用 DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源 DNA（ 目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因 DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（ cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。一、 DNA重组 的技术路线二、 基因工程的应用与前景三、 DNA体外重组常用的酶DNA重组 的 技术路线 Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA moleculeIntroduction into host cells by transformation of viral infectionHost chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制备2、 载体 的构建3、目的基因与载体的 重组4、重组 体 导入 宿主细胞进行扩增5、 克隆基因的鉴定Ti质粒结构植物冠瘿瘤pBR322质粒的结构以 噬菌体为载体进行 DNA克隆DNA用限制性内切酶除去中间一段与外源 DNA连接重组载体的体外包装带有外源 DNA的噬菌体太小不能被包装头部前体多联体DNAA蛋白COSCOS COS成熟的颗粒在宿主细胞内进行DNA的 装配过程噬菌体感染大肠杆菌的途径DNA重组体的筛选 载体特征的直接筛选 菌落的原位杂交 免疫学方法pBR322质粒结构如果外源 DNA插入， 氨卞青霉素抗性基因失活如果外源 DNA插入， 四环素抗性基因失活原位杂交法筛选DNA重组体 图解复印至硝酸纤维素膜上用 NaOH菌体裂解 DNA变性杂交放射自显影32P-cDNA与 放射性 cDNA杂交的菌落的斑点细菌菌落单链 DNA结合到膜上Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有 DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有 DNA片段的膜Southern和 Western 印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gel AutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by specific antibodyAutoradiographyDNA重组技术的应用(1) 开辟生物学研究的新纪元反向生物学（ invese biology） 的诞生（ 2）促进生物技术产业的兴起基因药物基因诊断和治疗转基因动植物胰岛素原的人工合成胰脏(A)n胰岛素原 mRNA cDNA 重组质粒 转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接感染E.coli胰岛素原Ti质粒为载体的植物基因工程I 二元载体系统II 共整合 载体III T-DNA的转移与整合Ti辅助质粒 Ti辅助 DNA给体质粒Ti辅助 DNA给体质粒pBR型质粒（ 给体质粒）宿主特异性外源基因宿主特异性整合带有外源基因的 Ti质粒 植物 DNATi质粒转移并插入植物 DNA第二节 蛋白质工程简介蛋白质 技术和核酸技术的相互增强在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并不合意，需要加以改造。 1983年美国基因公司的 Ulmer首先提出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程的重要组成部分。蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料 ，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计， 改造蛋白质或构建新的蛋白质 。研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及抗体等）和工业用酶的 蛋白质工程 。生物酶工程示意图酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图 选择性修饰方案突变酶 新酶克隆酶产品效用发展 酶基因遗传设计遗传修饰DNA重组技术DNA重组技术蛋白质技术和核酸技术的相互增强插入表达载体 转化寄主细胞推导出AA顺序 制备合成肽 制备对所编码蛋白 专一的抗体基因或cDNA蛋白质蛋白质测定出AA顺序合成 cDNA探针制备专一的抗体 沉淀核糖体分离 mRNA用 Southern印迹法筛选 DNA文库基因或cDNA第三节 核酸研究技术简介一、 DNA序列测定二、 基因文库与 cDNA文库三、 聚合酶链式反应 （ polymerase chain reaction, PCR）DNA测序的基本战略设法产生带标记的不同长度的成套 DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的 DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过 PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的 DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测 DNA的碱基序列。酶法 化学法 测序技术进展酶法序列分析的原理酶反应电泳方向模板 CCGGTAGCAACT3 5GG5 3引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCG GGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G TAGTTGCTACC35TCAACGATGG53读出模板互补序列读出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的Sanger测序法(酶法 )读出模板互补序列dNTP凝胶电泳较大片段较小片段ddGTPddATP ddCTP ddTTP反应混合物Klenow酶未知序列的单链 DNA读出待测序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3放射性标记的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT35CTGACTTCGACAA53DNA的测序仪示意图computer analysis凝胶中 DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜 /棱镜组件DNA的化学测序示意图反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应： NaCl+肼测序技术进展同位素标记到荧光标记 ,平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记毛细管电泳 单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳ACG T A C G T测序图谱T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T引物标记法测序引物标记法测序 (Dye Primer)一个样本， 4个反应。 4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+ AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddATP (terminator)+ AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddCTP+ AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddGTP+ AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddTTP反应结束后，将 4管反应液混合，经乙醇沉淀后上样终止法测序终止法测序 (Dye Terminator)一个样本， 1个反应。反应中包含分别带 4色荧光标记的 ddNTP(终止子 )unlabeled primertemplate DNA+AmpliTaq FSdATP, dCTP, dGTP, dTTPddCTPddATPddGTPddTTP测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的行纯化，除去过量的 ddNTP后上样。后上样。三基因文库与 cDNA文库1 基因文库 （ genomic library）cDNA文库 （ complemental DNA library）2 . 文库的构建 基因文库基因文库是指整套由基因组 DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用 DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为 genomic library。基因文库中应包含多少 DNA克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：N=ln(1-p)/ln(1-f)N 基因文库所包含克隆的数目；p 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99% ；f 克隆的 DNA片段大小（ bp） 占基因组大小 (bp)的分数。cDNA文库真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经 RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成熟的 mRNA反转录成 cDNA （ complemental DNA） 接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于 mRNA的不稳定性，对基因表达和有关 mRNA都 通常通过对其 cDNA来进行研究的。将细胞全部 mRNA反转录成 cDNA并 被克隆的总和称为 cDNA文库。 RNA病毒的基因组是 RNA， 也必须将RNA先转录成 cDNA， 再建立文库。为使低丰度的 mRNA的 cDNA克隆存在的概率大于 99% ，