发酵大题范围

参数检测例：鸟苷生产在鸟苷发酵中，发现发酵到 40小时后鸟苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖 ,使发酵过程 pH下降，补入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是进行以下一些测定与分析什么因素导致 pH下降？1、有机酸的积累有机酸积累 pH下降 补加氨水在正常代谢情况下，细胞通过 EMP途径和TCA循环的过程是为细胞合成提供前体和能量的，按照细胞经济学的原则不会供过于求，即不会出现有机酸的积累若发酵后期有机酸积累会引起加入的 NH4+积累，相应出现产苷速率下降。 代谢不正常测定以下中间物发酵后期丙酮酸积累2、氨基酸的积累在有机酸分析的基础上进一步通过 HPLC测定发酵过程中不同时间发酵液中氨基酸，结果发现总氨基酸积累并且其积累晚于有机酸和 NH4+积累。氨基酸成分分析表明，初始发酵液中谷氨酸浓度比较高，其它氨基酸浓度都较低，随着发酵过程的进行谷氨酸很快被用于菌体合成，在 8小时之前已经降到很低水平，并始终维持在低水平，而在 48小时左右丙氨酸开始出现明显的积累，发酵液中积累量达到初始量的 12.6倍之多，其它十余种氨基酸浓度则变化不大，并且在整个发酵过程中都维持在较低水平。因此，丙氨酸浓度变化可能是导致代谢流迁移所致。3、分析原因发酵过程中积累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸转化而来，因此可以推断由于 EMP途径代谢流的增加造成了丙酮酸的积累，丙酮酸随后转化为丙氨酸丙氨酸本身又会对谷氨酸合成酶（ GS） 造成反馈抑制和阻遏，使产苷速率降低。恶性循环激活磷酸果糖激酶丙酮酸积累 氨水补加增加NH4+积累 抑制 GS抑制 TCA循环 丙酮酸积累EMP流量增加丙氨酸积累（二） 代谢流迁移的酶学证明糖代谢途径关键酶糖酵解途径（ EMP）在糖酵解途径中有两个不可逆的步骤的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的时序分析12小时时由于生长处于对数生长初期，代谢活力较低，所以 PFK的活力相对较低。 24小时后随着发酵过程进入平稳产物形成期和细胞生长期，磷酸果糖激酶的活力也基本保持平稳。但是到 40小时以后，鸟苷形成速率减慢甚至停止，同时观察到氨基酸和有机酸积累， PFK相对酶活增加，这表明此时通过 EMP途径的糖代谢通量已有了明显的增加。 丙酮酸激酶时序分析丙酮酸激酶没有表现出明显的酶活增加，而是在 24小时就基本上达到其最大值，随后维持在恒定的水平，这表明在糖代谢时EMP途径代谢流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代谢流迁移的主要因素 磷酸戊糖途径（ HMP）关键酶磷酸戊糖途径中主要的限速酶是 6磷酸葡萄糖脱氢酶，该酶催化 6磷酸葡萄糖脱氢生成 6磷酸葡萄糖酸内酯 。6磷酸葡萄糖脱氢酶时序分析由图可以看到，早期 6磷酸葡萄糖脱氢酶活力很高，这可能是前期菌体合成代谢比较活跃，通过 HMP途径合成用于细胞成分的核酸等组成物质；随后基本不变，从而保持 EMP和 HMP途径通量的平衡，此时稳定持续的形成产物；但是到 40小时后， 6磷酸葡萄糖脱氢酶已经表现出明显的下降趋势，并且随着后期发酵过程的进行而持续下降。根据物料平衡原则，有可能糖代谢在 HMP途径通量下降而 EMP途径通量增加。三羧酸 (TCA)循环的关键酶三羧酸循环是 “消耗 ”丙酮酸的途径，三羧酸流量大丙酮酸不会积累。三羧酸循环中的关键酶为 柠檬酸合成酶 ，其催化乙酰辅酶 A与草酰乙酸缩合形成柠檬酸，是三羧酸循环的启动步骤，也是三羧酸循环中的主要控制点，由柠檬酸合成酶所催化的反应是三羧酸循环中的第一个限速步骤。柠檬酸合成酶时序分析从图可以看到， TCA循环的关键酶柠檬酸合成酶在整个发酵过程中，尤其是在后期产苷速率下降的过程中都维持比较平稳的水平，这表明在发酵过程后期所发生的代谢流迁移时， TCA循环的通量并没有发生明显的增加。即 代谢流迁移发生在 EMP和 HMP之间，主要是由于EMP和 HMP途径之间的分配平衡被打破所造成的。 EMP途径代谢流的增加造成了一种代谢流的溢流现象。丙氨酸脱氢酶的时序分析在发酵中后期，丙氨酸脱氢酶活力出现了明显的增加。丙氨酸脱氢酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，该酶活性增加与丙酮酸和丙氨酸的时序增加相吻合，这些数据表明代谢流的溢流现象发生在柠檬酸合成酶之前的丙酮酸节点，通过丙氨酸脱氢酶生成丙氨酸，从而缓解了 EMP途径代谢流增加造成的代谢不平衡。结果加入 EMP途径的抑制剂，克服了代谢流迁移的问题，提高了鸟苷的产量基因工程菌（三）基因不稳定性生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。基因的不稳定性原因：l分离丢失l结构不稳定性l宿主细胞调节突变 1、分离丢失 指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象 。为什么会出现质粒丢失呢？质粒可分为高拷贝质粒（ 20拷贝 /细胞）和低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子代细胞。对于高拷贝质粒，绝大多数子细胞接受一些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，出现质粒丢失。虽然形成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中一个）。在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在无质粒细胞，例如 1000L发酵液，每毫升有 109个细胞，总共就有 1015个细胞，那么在这个反应器中就含有 109个无质粒细胞。质粒的分离丢失受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在一起形成一个单位。分离丢失示意图2、质粒结构不稳定性 指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 。 如果质粒发生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来的工程菌更快，使得在这种培养物中带有突变质粒的菌占统治地位，这种培养情况就是结构不稳定性。3、宿主细胞突变 宿主细胞的突变也会造成生产能力的下降。这些突变通常 改变细胞调节 ，结果减少目标蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如 IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进入细胞，从而不能启动细胞的表达。4、生长速率占优势的不稳定性所有这三种因素的关键是变异了的宿主载体系统和原宿主 -载体系统的生长速率不同。如果变异了的宿主载体系统比原来的宿主 -载体系统有生长优势，那么变异了的系统将最终占优势，基因不稳定性就出现。 （四）表达的诱导基因工程菌的产物表达需要诱导，诱因主要有：温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。提高质粒稳定性的方法1、两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢 失菌的生长。 2、通过控制环境参数（温度、 PH、 培养基组分和溶解氧浓度），调节比 生长速率，使工程菌生长具有优势。有些含质粒的菌对发酵环境的改变 比不含质粒的菌反应慢，因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比 生长速率，可以改善质粒的稳定性。染菌3、不同时间染菌对发酵的影响污染时间是指用无菌检测方法确准的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。杂菌进入培养液后，需有