基因工程重组蛋白的分离纯化放映

基因工程重组蛋白的分离纯化生物工程下游技术第七组马夕尧意义？ 生物工程以基因工程为核心，主要产品为蛋白质或多肽。通过多年的努力，我国基因工程“上游”已与国外差距缩小，但“下游”技术，尤其是蛋白质纯化处理与先进国家相比， 仍有很大差距。目录 一获得基因工程产品的特点 二建立蛋白质纯化工艺的依据 三蛋白质分离纯化应遵顺的原则 四分离纯化的基本过程 五几种主要蛋白质分离纯化的方法优缺点对比一获得基因工程产品的特点 目的产物在初始物料中含量低，而且往往在细胞内。含目的产物的初始物料组成复杂，除了目的产物外，还含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，特别是产物降解酶、产物类似物等对目的产物的分离影响很大。 .目的产物一般是大分子物质，稳定性差，具有生物活性的物质对pH值、温度、金属离子、有机溶剂等十分敏感，容易失活、变性； .种类繁多，包括有大、中、小分子，结构简单或复杂的有机化合物以及结构复杂又性质各异的生物活性物质。对这些大分子基因工程产品的纯化缺乏必要的数据，似乎每种蛋白都有其独自的纯化方案，放大也往往凭经验，不像抗生素等小分子物质有很多数据可指导放大。 .应用面广，往往是注射用，对其质量、纯度要求高，无菌、无病毒、无热原。二建立蛋白质纯化工艺的依据2.1目标蛋白的各种性质 分子量大小，大的蛋白质先过凝胶柱； 分子形状，球蛋白易扩散人凝胶过滤柱填料颗粒的小孔内，较迟洗脱出来； 电荷与电荷分布，与离子交换紧密相关； 疏水性，与疏水层析、反相高压色谱有关； .溶解度，影响因素有 pH值、离子强度、离子的性质、湿度和溶剂极性等，可用于沉淀分离； 密度，磷蛋白等密度大，可用密度梯度法分离； 配体结合能力，用于亲和层析； 金属结合能力，用于鳌合有金属离子的亲和柱； 翻译后修饰，如连有糖基的蛋白可用于含有外源凝集的亲和柱，磷蛋白质在某些糖基下能与鳌合有 FeZ的柱子结合 。2. 2物料中杂质的种类和性质 包括杂质的种类和含量、化学性质、分子结构、相对分子量、电荷性及数量、生物学特性、稳定性 (对于热、 pH值、盐、有机溶剂等 )、溶解度、吸附性能等。2. 3初始物料的特点菌种类型及其代谢特性，包括菌种表达方式 (是否以包含体形式 )、副产物种类、产物类似毒素、蛋白酶种类、原材料和培养基的来源及其质量；生产工艺和条件，包括灭菌方法和条件、生产方式 (连续、批式、半连续 )、生产周期、生产能力、工艺控制条件、因素及方式等；初始物料的各种性质，包括产物浓度、杂质种类、浓度变化、盐的种类、浓度、溶解度、 pH值、粘度等。2.4产品质量的要求 产品质量标准和用途对产品纯度、生物活性、比活的要求 。 包括允许杂质种类和最大允许含量，特殊杂质种类和最大允许量 。 以及杂质对使用的影响、产品剂型、贮存稳定性等。三蛋白质分离纯化 应遵顺 的原则具有良好的稳定性和重复性。尽量不变或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响，使产品规格统一。必须明确严格控制的步骤和技术，以及允许的变化范围。步骤之间尽量能衔接，减少工艺的步骤，同时工艺与设备也要相互适应，一般分离原理相同的技术在工艺中不要重复使用，既可减少周期，又能提高纯度和得率。技术条件要温和，温度低， PH值适中，能保持目的产物的生物活性。工艺过程中要尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步骤或干扰产品质盆。周期尽量短，因稳定性差的产物随工艺时间增加，收率、质量会下降。目的蛋白质选择性好，能从复杂的混合物中将目的产物有效地分离出来，达到较高纯化倍数。工艺和技术必须快速高效、收率高、易操作、对设备条件要求低、能耗低。具有较高的安全性。在选择处理技术，工艺和操作条件时，要确保去除有危险的杂质，保证产品质量和作用安全以及生产过程的安全，药品生产必须保证安全、无菌、病毒、热原。四分离纯化的基本过程 样品的固液分离与预处理基因工程药物多为胞内产物，分离提取这类物质时，需要经细胞收集细胞破碎细胞碎片分离等步骤 层析纯化细胞破碎针对这种结构，细胞破碎方法有机械破碎法和非机械破碎法，可以根据生产规模和活性蛋白在细胞中的位置，选择适当的方法。 机械破碎法是常用的方法，速度快，处理量较大，不会带人其他化学物质，但在处理过程中产生热量，必要时要采取冷却措施，以防止目的产物失活。现常用方法有高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法。 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法。酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖昔酶、肤链内切酶、壳多糖酶等。溶菌酶对细菌类作用效果好，其他酶对酵母作用效果好。利用酶溶法处理细胞时必须根据细胞的结构和化学组成选择合适的酶 .并确定相应的使用次序，控制好温度、 pH值和酶量。化学渗透法利用一些有机溶剂 (苯、甲苯 )等可以改变细胞壁或细胞膜的通透性，从而使内含目的产物有选择地渗透出来。细胞壁是由坚固的多聚糖、乙酸葡萄糖胺和乙酞胞壁酸所形成的网状结构，具有一定的韧性。分离细胞碎片分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方法，使细胞碎片分配在一相 (通常为下相 )而分离，同时也起部分纯化作用；得到的上清液可以通过硫酸氨分级沉淀、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、超滤浓缩脱盐等进行预处理，有些可以进行特殊处理，如加热、三氯乙酸处理等除去杂蛋白。以枯草杆菌、毕赤酵母等作为基因工程菌的话，由于都是外分泌，直接用离心、过滤等方法进行分离，可以加人一些助滤剂等利于分离。层析纯化 预处理的产物可能仍与大量的杂质混合在一起，这类杂质可能有病毒、热原质、氧化产物、核酸、多聚体、杂蛋白、与目的物类似的异构体等。进一步纯化主要依赖色谱分离方法，其优点是具有多种多样的分离机制，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。 层析纯化方法设计应根据目的蛋白和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质差异，例如表面电荷密度、对一些配基的生物学特异性、表面疏水性、表面金属离子、糖含量、自由疏基数目、分子大小和形状 (相对分子质量 )， pl，和稳定性等。选用的方法应能充分利用目的蛋白和杂蛋白间上述差异 离子交换色谱 (ion exchange chromatography , IEC ) 疏水色谱 (hy