基因工程-2-载体

质粒载体载体 噬菌体载体 动物病毒载体大肠杆菌质粒载体 pBR322 单链 DNA M13载体 SV40载体 乳头瘤病毒载体 昆虫杆状病毒载体 柯斯 (COS)载体 噬菌体载体 枯草杆菌质粒载体 pNC3 酵母菌质粒载体 2 农杆菌 Ti质粒载体 Ti 一 基因工程的基本元件-载体四、 E.coli质粒载体 1.pBR322是基因工程中最重要的一个人工质粒 ,有万能质粒之美称 .pBR322 的构建a) 复制子 :松弛型b) 选择标记 :Amp、 Tet c) 筛选形式 :抗性插入失活d) 单一切点 :24个 物理图谱 pBR322的特性pBR322plasmidF. BolivarR. L. RodriguezBacterial ResistancepBR322酶切图谱2.pUC系统美国加利福尼亚大学的科学家 J. Messing和 J. Vieria于1987年首先构建 来自 pBR322质粒的复制起点 氨苄青霉素的抗性基因 大肠杆菌 -半乳糖酶基因的启动子及其编码的 -肽链基因（ lacZ） 位于 lacZ基因内的一段 MCS区段2.pUC系统X-gal 溴氯吲哚 + - 半乳糖苷-蓝白斑筛选插入片段 无酶活性 白斑未插入片段 有酶活性 蓝斑- 半乳糖苷酶3. TA载体经 Taq DNA 聚合酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单个 A 酵母菌质粒载体 食品级微生物 适合于真核基因表达 基因产物外分泌七、酵母菌质粒载体 多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链 DNA，称为2 质粒，长约 6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（ ARS片段）。 整合型、复制型、附加型和稳定型 等类型。 含有 E.coli质粒的复制起始序列。 含有酵母的筛选标记（如 LEU2） 具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。2.酵母菌质粒载体的特点1.酵母菌质粒载体的类型Type Name Descriptionbacterial origin ColE1 ColE1 (pUC-type) origin of replicationpromoter Gal1-10 promoter Gal1-10 yeast promoterselectable marker ampR ampicillin resistance geneselectable marker chlR chloramphenicol resistance gene LOST in recombined (with insert) formselectable marker URA3 URA3 auxotrophy selectable marker (yeast)yeast centromere CEN4 yeast centromeric sequenceyeast origin ARS1 ARS1 yeast origin of replication 酵母菌 稳定型 质粒载体 着丝粒第二节 噬菌体载体一、 噬菌体载体 1. 噬菌体结构特点 : 线性双链 DNA分子 可在 E.coli中大量繁殖 具非必需区 (约 1/3长度） 两端具 12个核苷酸单链互补粘性末端 噬菌体线性 DNA分子的粘性末端及其环化作用（ a）具有互补单链末端（粘性末端）的 DNA分子。（ b）当进入宿主细胞后，通过粘性末端之间的碱基配对作用实现的线性分子的环化作用，由此形成的双链区叫做 cos位点GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATA CGcos5-P5-P33粘性末端环化作用（ a） （ b）2、 噬菌体的缺陷与改造噬菌体的缺陷： 酶切点太多5个 BamH1位点， 6个 Bgl 位点， 5个 EcoR 位点。 野生型只能接纳一定长度的 DNA。 噬菌体的 75-105%，只能接纳 49kb5%=2.45kb 的 DNA。 噬菌体的改造： 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（ 15-23Kb）； 去除过多的酶切位点，每种酶只留 1-2个切口； 增加选择标记基因（ selectable marker）； 建立 DNA的体外包装。主要外壳蛋白质是基因 E的产物头部前体连环 DNA基因 A的产物在 cos位点切割噬菌体 DNA包含在外壳中的基因 D的产物基因 W和 FII的产物组装蛋白质加完整的尾部噬菌体的包装过程sup-细菌头部基因（琥珀突变型）尾部基因（琥珀突变型）转录复制蛋白质合成组装尾部所需要的组分“无头部 ”的提取物组装头部所需要的组分“无尾部 ”的提取物温育完整的噬菌体转录复制蛋白质合成T4噬菌体的体外包装 DNA的体外包装体外包装的重组 DNA比裸露的 DNA导入受体细胞的效率高 100-10000倍4.凯伦噬菌体载体克隆过程5.噬菌体载体优点 :用途 :主要用于建立真核生物的基因文库 感染高效 :比质粒高百倍 容量大 :可达 15Kb(不得超过原来长度的 105%,不得短于原来长度的 75%) 易操作 ,易保藏 二、 柯斯 (COS)载体 (cosmid) 1.柯斯载体的组成 带有抗药性标记 带有质粒的复制起始点 带有多个限制酶的单一切点 带有 噬菌体粘性末端片段 由质粒和 粘性末端 “尾巴 ”两部分组成。2.柯斯载体的特点 3.cosmid载体的优点 能象 DNA 一样体外包装，并高效导入受体细胞 可以装载比质粒或 DNA 大得多的外源 DNA片段cos区 1.7 kb+质粒部分 3.3kb 46.5Kb 外源 DNA 由于携带质粒的选择标记，便于筛选 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。 利用柯斯载体载体进行基因克隆的一般程序三、 M13噬菌体克隆载体 1.M13的特性 :环状 ,单链 DNA,6.407Kb 2.M13噬菌体作为载体 优越性 单链 DNA噬菌