基因工程基本原理简介

第十章 基因工程基本原理简介本章的重点内容：1. 什么是基因工程？2. 获得目的基因的方法有哪些？3. 如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？4. 基因工程中的最新技术。第一节 基因工程原理简介一、基因工程的定义本义： 根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的 基因 /DNA片段 的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。广义： 转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。目的基因获得表达载体构建基因的导入表达的鉴定核酸鉴定： PCR; Southern and Northern blot.蛋白鉴定： SDS-PAGE; HPLC; Western blot.功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。原核 :包涵体 ,分泌型真核 :文库合成PCR基因组文库cDNA文库细菌：氯化钙；电穿孔 ;细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射； V;动物：微注射；电穿孔；精子； ESC； RT-V；载体质粒 (plasmid)粘粒 (cosmid)噬菌体 ()第二节 基因工程的基本步骤和方法第三节 基因工程中的通用技术一、核酸的提取纯化与定量包括 RNA、 DNA及 plasmid DNA的提取纯化技术 二、核酸电泳技术1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE 500200010007501002001 DL2000 marker2 BamH1和 EcoRI双切3 BamH1单 切4 Hind 单切5 重组质粒 pVAX1/ABPS11 2 3 4 5三、核酸探针（ probe） 1. 原理； 2. 标记物； 3. 种类； 4. 应用 Dot blot、 Southern blot： DNA、 Northern blot： RNA四、 Western blot: Protein一、获得目的基因的方法基因文库 （ cDNA文库和基因组文库），化学合成， PCR 等方法。还有 DD-PCR以及 基因芯片 等技术。（一） 基因组文库目的： 种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控序列的克隆等。第四节 基因工程中的常用技术家蝇部分基因组文库构建、卵黄蛋白基因启动子克隆与初步应用研究Cloning and initial application of functional promoter of Musca domestica yolk protein gene启动子克隆一般思路启动子区 杂交增强子 调控启动子 核心启动子 基因3 5转录起始点 探针+50-40ATG-4000 -500功能 分析 克隆启动子实验一、家蝇部分基因组文库的构建1 材料与方法 1.1 家蝇基因组 DNA的提取 2.1 基因组 DNA的 部分酶切 3.1 EMBL3载体臂的制备 4.1 连接与包装 5.1 基因组文库鉴定 Bcl I随机酶切左臂 基因组 DNA 右臂 left arm（ 20kb） central stuff 14kb right arm9kbEcoR IBamH ISal IBamHSal IEcoR I基因组 DNABamH I+CIPBcl I Bcl I BamH I BamH I包装转化KW251噬菌斑 1023kb包装蛋白实验一、技术路线图重组噬菌体收集噬菌体液基因组文库1. Genomic DNA2. Lamba DNA Fig.1 electrophoresis of genomic DNA图 1.基因组 DNA电泳1 248.5kb 实验一结果 2.1 基因组 DNA的提取提取的基因组DNA 大于 50kbFig.2 Digestion of genomicDNA by Bcl I1. 5U/ugDNA Bcl I ， 2. 2.5U/ugDNA Bcl I3. 1.25 U/ugDNA Bcl I4. Lamba DNA/Hind Marker图 2. 基因组 DNA Bcl I 酶切电泳23kb 9.4kb1 2 3 4Fig.3 Electrophoresis of recover products of 1023kb DNA fragments1. Bcl I 酶切纯化片段2. Lamba DNA/Hind Marker图 3. 1023kb DNA片段回收 产物电泳23kb9.4kb1 2 实验一结果 2.2 家蝇基因组 DNA酶切和纯化纯化了 1023kb的 Bcl I酶切 DNA片段实验二、 家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析 特异性探针噬菌斑原位杂交鉴定可疑阳性克隆亚克 隆文库液转化KW251噬菌斑三次纯化噬菌斑原位杂交-DNA 提 取 阳性克隆单酶切和双酶切Southern BlotHind III XhoI目的 DNA片段测序 序列分析实验二、技术路线实验二结果GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAA CAAGAAGTCA CCGTTTTCATCACCGGTCTG CCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黄蛋白基因部分 DNA片段特异性探针序列2.1 特异性探针制备制备了大小为 768bp的地高辛标记的 DNA片段特异性探针，工作浓度为 1： 2000。实验二结果 2.2 阳性克隆的筛选和纯化1# positive clone（ about 2000 plaques/plate）Fig.3 Screening result of 1st round situ hybridization图 3 第一次噬菌斑原位杂交筛选结果YP1 2# positive clone（ about 200 plaques/plate）Fig.4 Screening result of 2nd round situ hybridization图 4 第二次噬菌斑原位杂交筛选结果Numbers： 11 positive clone（ 11 plaques/plate）Fig.5 Screening result of 3rd round situ hybridization图 5 第三次噬菌斑原位杂交筛选结果获得了含家蝇卵黄蛋白基因的阳性克隆2.0 2.3 4.4 6.6 9.423 1.4 1.6 2.0 3.5 4.3 5.0 21 1 2 3 4 5 6 kb kb Fig.6 Digestion analysis of recombinant -DNA of positive plaque图 6 阳性克隆 -DNA的酶切分析实验二结果 2.3 mdYP基因组基因的克隆1:Lambda DNA/Hind Marker 2: Xho , 3: Xho /Hind , 4: Hind , 5: Sal6:DNA/EcoR +Hind Marker3.5 kb 1 2 41:Xho I， 2:Hind 3:Xho /Hind Fig.7 Southern blot of recombinant -DNA of positive plaque with mdYP1 DNA probe DIG-labeled 图 7 阳性克隆 -DNA的 Southern blot实验二结果 2.3 mdYP基因组基因的克隆1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT 700701 TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA 800801 ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG 900901 ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA 10001001 ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT 11001101 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AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG 2100获得了全长 3991bp的基因组序列，包含 1.7kb卵黄蛋白基因组基因及其 5-调控区序列。2101 AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG 22002201 CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC 23002301 ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG 24002401 AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC 25002501 TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC 26002601 TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG 27002701 CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA 28002801 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The intron region(1886 1947) is marked by underlining, the TATA box or the