实验七细胞骨架观察

细胞骨架组分的细胞骨架组分的荧光染色观察荧光染色观察实验目的 掌握细胞骨架的显示方法 掌握荧光显微镜的使用方法 了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构背景知识细胞参量 荧光探针 吸收 /发射 nm 特性DNA和 RNA Propidum iodide(PI) 535/617 红色荧光嵌入核酸双链间 ,只能标记死细胞 .用于 染色体 ,细胞观察 ,分辨死活细胞和细胞周期研究Ethidium bromide(EB)518/605红色荧光嵌入核酸双链间 ,只能标记死细胞 .用于电泳分析 ,染色体观察DAPI 358/461 蓝色荧光 半通透细胞 ,结合于 DNA的 AT碱基对 .用于细胞周期的研究 ,染色体和细胞核的观察Hoechst33342 350/461 蓝色荧光结合于 DNA的 AT碱基对 ,可进入活细胞 ,用于细胞周期的研究 ,染色体和细胞核的观察蛋白和抗体的耦联探针FITC 494/518 绿色荧光 染死细胞 ,对 PH值变化不敏感Texas red 595/615 红色荧光多参量细胞标记溶酶体 Neutral red 541/640 红色荧光探针微偏碱性 ,可标记溶酶体等酸性细胞器线粒体 Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光可进入活细胞 ,阳离子性 ,摄入快 ,淬灭快 ,无毒性常用荧光探针介绍狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。细胞骨架*微管*微丝*中间纤维背景知识 S.D.Pone用 考马斯亮蓝染 人皮肤成纤维细胞的细胞骨架获得成功。 1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。 当细胞用适当浓度的 triton X -100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容易被去除 ，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。细胞骨架研究中常用药物药物名称 作用细胞松弛素 B (cytochalasin B, CB)结合在微丝的正端，阻抑其聚合，同时提高临界浓度，最终导致微丝的解聚鬼笔环肽 (phalloidine)强烈亲和微丝，结合在微丝中actin亚单位之间，稳定微丝、促进微丝聚合秋水仙素（ colchicine） 阻断微管蛋白组装成微管紫杉醇（ taxol） 促进微管的装配，稳定已形成的微管实验原理 鬼笔环肽 (phalloidin) 是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反 , 只与聚合的微丝结合 , 而不与肌动蛋白单体分子结合。它 同聚合的微丝结合后 , 抑制了微丝的解体 , 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。 由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白 , 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响 . 此外 , 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用 . 因此 , 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法 . G-actin F-actinATP、 Mg2+、高 K+、 Na+Ca2+、低 Na+、 K+实验步骤材料：CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞试剂： 1.PEM： 50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇2.0.5% Triton X-100溶于 PEM缓冲液中 。3.4%多聚甲醛溶于 PEM缓冲液中。 取出盖片，于小平皿中 37 预温 PEM洗 3次 (每次 1mL)Triton X-100处理约 10min(1mL)37 预温 PEM洗 3次 (每次 1mL)37 预温 4%多聚甲醛固定细胞 15min (1mL)37 预温 PEM洗 3次55nM Alex -phalloidin 10L湿盒中室温染色 30min。37 预温 PEM洗数 3次滴加 10L Ho.33342复染色用小砂轮切去用小砂轮切去长方形盖玻片的长方形盖玻片的一角作为标记以一角作为标记以便识别细胞面。便识别细胞面。细胞密度 60-80%注意盖玻片的正反面切勿产生气泡 ！在 parafilm 膜上加 PEM ，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。避光操作荧光镜下观察注意事项 注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面； 各步洗细