实验三霉菌、放线菌及土壤微生5

实验三实验三 霉菌、放线菌的形态霉菌、放线菌的形态观察及微生物的分离纯化观察及微生物的分离纯化 主讲：裴国风 程国军一、实验目的一、实验目的 观察放线菌、霉菌的形态结构特征观察放线菌、霉菌的形态结构特征 学习掌握霉菌染色的基本方法学习掌握霉菌染色的基本方法 基本掌握细菌、放线菌、霉菌菌落形态特征基本掌握细菌、放线菌、霉菌菌落形态特征实验（一）霉菌、放线菌的形态观察实验（一）霉菌、放线菌的形态观察二、实验原理二、实验原理放线菌放线菌 :是一类介于细菌和真菌之间的微生物，个体形态是一类介于细菌和真菌之间的微生物，个体形态复杂，复杂， G ，具多核的单细胞原核生物，是抗生素的主要产，具多核的单细胞原核生物，是抗生素的主要产生菌。它由不同长短的纤细的菌丝形成单细胞菌丝体。菌生菌。它由不同长短的纤细的菌丝形成单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。气生菌丝及化成孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。霉菌：凡在营养基质上形成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网形丝状霉菌：凡在营养基质上形成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网形丝状菌体的真菌，统称为霉菌。霉菌包括分类学上许多不同纲或菌体的真菌，统称为霉菌。霉菌包括分类学上许多不同纲或类的真菌，它们分别属于藻状菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和类的真菌，它们分别属于藻状菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。霉菌菌丝分为有隔菌丝和无隔菌丝两类半知菌类。霉菌菌丝分为有隔菌丝和无隔菌丝两类 .黑曲霉 属于半知菌亚门 , 菌丝有隔 ,细胞多核；部分气生菌丝细胞形成特化的厚壁、膨大的足细胞，由足细胞的中间稍呈垂直地向上延长，形成分生孢子梗。 青霉属于半知菌亚门 ,分生孢子梗基部无足细胞，孢子梗顶端不膨大成囊，而是多次分枝形成扫帚状，小梗末端形成分生孢子。根霉横向生长的菌丝产生假根，附着在基质上。 菌丝无隔、无性生殖产生孢囊孢子，有性生殖产生接合孢子。三、实验材料三、实验材料放线菌和真菌培养物放线菌和真菌培养物1. 放线菌培养物放线菌培养物2. 黑曲霉培养物。黑曲霉培养物。 3. 黑曲霉黑曲霉 、根霉、青霉、根霉、青霉 示范片。示范片。 显微镜、载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、酒精显微镜、载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、酒精灯、镊子等。灯、镊子等。 乳酸石炭酸棉兰染液、碘液、酒精、蒸馏水等。乳酸石炭酸棉兰染液、碘液、酒精、蒸馏水等。主要观察黑曲霉菌丝分隔情况和主要观察黑曲霉菌丝分隔情况和分生孢子着生情况（辨认分生孢子着生情况（辨认 顶囊顶囊 、分生孢子梗、足细胞和分生孢子分生孢子梗、足细胞和分生孢子）用解剖针挑取少量曲霉菌块（适当带一点培养基）放用解剖针挑取少量曲霉菌块（适当带一点培养基）放 在载玻片的一在载玻片的一侧侧 ,在菌块上滴在菌块上滴 50乙醇一滴乙醇一滴 ,轻轻拨动轻轻拨动 、 洗涤洗涤 菌块菌块 ，在同一玻片的，在同一玻片的另一侧加一滴水滴（或棉蓝染液），将洗去分生孢子的菌块置于另一侧加一滴水滴（或棉蓝染液），将洗去分生孢子的菌块置于 棉棉蓝染液蓝染液 中，用解剖针将菌丝尽量分散，盖上盖玻片，用橡皮或塑料中，用解剖针将菌丝尽量分散，盖上盖玻片，用橡皮或塑料请轻轻敲击，请轻轻敲击， 10x ,40x观察。观察。四、实验步骤四、实验步骤 插片法培养放线菌插片法培养放线菌取插片一片，直接在显微镜下进行观察取插片一片，直接在显微镜下进行观察，注意分界面两侧菌丝形态的差异，注意分界面两侧菌丝形态的差异 观察放线菌气生菌丝和基内菌丝、孢观察放线菌气生菌丝和基内菌丝、孢子丝的区别子丝的区别 载玻片直接观察法载玻片直接观察法方法同霉菌方法同霉菌五、实验结果五、实验结果记录所观察到的放线菌基内菌丝和气记录所观察到的放线菌基内菌丝和气生菌丝的差别生菌丝的差别绘制青霉（绘制青霉（ 40x） 、黑曲霉（、黑曲霉（ 40x） 的形态，注明各部分名称。的形态，注明各部分名称。六 、思考题、思考题 镜捡时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝 ?你主要根据哪些形态特征来区分上述霉菌 ? 你认为在显微镜下，细菌、放线菌和霉菌的主要区别是什么？ 实验实验 (二二 )、 从土壤中稀释分离微生物从土壤中稀释分离微生物一、实验目的：一、实验目的：学习学习 微生物稀释平板计数微生物稀释平板计数 及划线分离技术及划线分离技术二、实验原理二、实验原理 :采用适宜（选择）培养基和培养条件，或加入某种抑采用适宜（选择）培养基和培养条件，或加入某种抑制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微制剂有利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法生物的纯培养：常用稀释平板分离法和划线分离法在固体培养基上形成单个菌落。在固体培养基上形成单个菌落。分离细菌用牛肉膏培养基，分离真菌用马丁分离细菌用牛肉膏培养基，分离真菌用马丁 -孟加拉孟加拉红培养基。红培养基。依据一个单细胞在固体培养基上培养后可以长成一菌依据一个单细胞在固体培养基上培养后可以长成一菌落从而推算样品中含有多少细菌或真菌的活菌数目落从而推算样品中含有多少细菌或真菌的活菌数目分离细菌的同学（分离细菌的同学（ 1-4组）取一瓶牛肉膏培养基（组）取一瓶牛肉膏培养基（250ml 瓶）熔化后倒瓶）熔化后倒 12个个 平皿平皿 。分离真菌的同学分离真菌的同学 （ 5组组 ） 取一瓶马丁培养基（取一瓶马丁培养基（ 250ml瓶）熔化后，置水浴锅中瓶）熔化后，置水浴锅中 55 保温，于无菌台上加链霉保温，于无菌台上加链霉素和素和 孟加拉红各孟加拉红各 1ml，混匀后倒，混匀后倒 12个平皿。个平皿。三、实验步骤：三、实验步骤：（一）土样的采集（一）土样的采集菜园中采集土样，扒开表土层大约菜园中采集土样，扒开表土层大约 5 cm厚，取土样厚，取土样 10 g左右，左右，装于灭菌后的牛皮袋中，封口带回。装于灭菌后的牛皮袋中，封口带回。 （二）土壤悬液制备（二）土壤悬液制备准备准备 1瓶土壤悬液：称瓶土壤悬液：称 10克土壤放入带玻璃珠的克土壤放入带玻璃珠的 90ml瓶瓶装无菌水中，手摇振荡（装无菌水中，手摇振荡（ 20 min），）， 使土样分散。使土样分散。（三）倒固体琼脂培养基平板（三）倒固体琼脂培养基平板 (每组每组 12皿皿 )（四）悬液稀释（四）悬液稀释 无菌操作（从稀至浓将菌液涂布均匀）采用无菌操作（从稀至浓将菌液涂布均匀）采用 2， 3， 4 稀释液涂布马丁孟加拉红平板；采用稀释液涂布马丁孟加拉红平板；采用 3，4， 5 稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板 ;每个稀释度每个稀释度 2个个重复。每人用剩下的重复。每人用剩下的 1个平板做划线分离，从三角瓶中个平板做划线分离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分离取土壤悬液作划线分离 .每个培养皿加 0.1ml 稀释液(五五 )平板涂布平板涂布简单易行，但易简单易行，但易造成机械损伤造成机械损伤Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod. （六）吹干（六）吹干将已涂布好的平皿皿盖半揭开，置于无菌将已涂布好的平皿皿盖半揭开，置于无菌台上吹干。台上吹干。（七）培养：（七）培养：待吹干后，将平板用报纸包好（每个平板方向待吹干后，将平板用报纸包好（每个平板方向一致），写上班级和姓名，皿底朝上，置于培一致），写上班级和姓名，皿底朝上，置于培养箱培养养箱培养 (温度温度 ?) 。（八）检查结果（八）检查结果结果分析结果分析 :1. 我所涂平板种类：我所涂平板种类： （牛肉膏或马丁（牛肉膏或马丁氏）氏）2. 计数：牛肉膏平板取单菌落数目在计数：牛肉膏平板取单菌落数目在 30 300个个左右的稀释度来计数，马丁氏平板取单菌落数目在左右的稀释度来计数，马丁氏平板取单菌落数目在10 100个左右的稀释度来计数个左右的稀释度来计数3.我所计数的平板稀释度是：我所计数的平板稀释度是： 单菌落单菌落数目：数目： 、 、 。4.计算：活菌数目计算：活菌数目 /每克土壤每克土壤 （计算过程）计算过程） 个个 /每克土壤每克土壤5. 对你和同伴的细菌及真菌计数结果进行分析对你和同伴的细菌及真菌计数结果进行分析平皿划线分离法试管斜面接种1.两支试管呈 “ V” 字形 2.拔下试管塞3.火焰上微烧一周 4.接种环灼烧、冷却5.接种 、划线 6.塞上塞子，灼烧接种环实验报告实验报告从土壤中稀释分离微生物从土壤中稀释分离微生物 的的 原理、方法、步骤。原理、方法、步骤。2思考题思考题(1)为什么融化后的培养基要冷却至为什么融化后的培养基要冷却至 45 左右才能倒平左右才能倒平板板 ?(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键 ?为为什么什么 ?(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。缺点及应用。(4)当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里在一起时，你认为问题出在哪里 ?(5)用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同何不同 ?为什么要培养