实验八聚炳烯凝胶电泳

血清蛋白的分离 -聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1)学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术二 . 基本原理(一 ) 电泳电泳 : 带电颗粒在电场的作用下 ,向着与其电性相反的电极移动的现象 .(二 ) 聚丙烯酰胺凝胶电泳用丙烯酰胺 (Acr)单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合成的多孔介质 .以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (简称 PAGE)。1. 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性(1) 凝胶有弹性，机械性能好；几乎无吸附和电渗作用，样品分离重复性好；(2)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度较高。(3)凝胶孔径可调节，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(4)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。分子量范围 适用的凝胶浓度 /(%)104 20-30 1-410 4 15-201-510 4-110 5 10-15 110 5 5-10 510 5 2-5 蛋白分子量范围与凝胶浓度的关系2. 凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关3 凝胶聚合催化体系（ 1）光催化：核黄素（ 2）化学催化： AP-TEMED 催化体系Bis将单体长链间连成网状结构化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 催化剂和加速剂的浓度 pH 碱性条件 温度 分子氧 杂质4.聚丙烯酰胺凝胶种类(1) 连续系统与 不连续系统 两大类不连续系统 :是指使用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连续系统不可比拟的优越性，分辨率高。(2)不连续体系 :电极缓冲液、浓缩胶及分离胶浓缩胶 是由 AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为 pH 6.7的 Tris-HC1。分离胶 是由 AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为 pH 8.9 Tris-HC1。电极缓冲液 是 pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。1) 样品浓缩效应A. 凝胶孔径不连续性B. 缓冲体系离子成分及 pH值的不连续性C. 电位梯度的不连续性2) 分子筛效应3) 电荷效应(3) 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用三 . 实验器材1、电泳仪 ,电泳槽及其附件2、培养皿3、摇床4、烧杯5、移液管6、微量进样器7、针管电 泳 装 置电泳仪：提供直流电在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移垂直平板电泳槽每组（ 3人）做一板胶，前后可安置两副板，两组共用一套电泳装置。四 . 实验试剂1. 人血清；2. 分离胶缓冲液： Tris-HCl缓冲液 PH8.9；3. 浓缩胶缓冲液 : Tris-HCl缓冲液 PH6.7；4. 分离胶贮液 :Acr 28.0g,Bis 0.735g,无离子水溶解定容至 100ml； 5. 浓缩胶贮液 : Acr10.0g,Bis2.5g,无离子水溶解定容至 100ml；6. 过硫酸铵溶液（ AP） 7. 电泳缓冲液 : Tris-甘氨酸缓冲液 PH8.3；8. 固定染色液9. 脱色液(一 ) 垂直平板电泳槽的安装(二 ) 凝胶的制备(三 ) 加样(四 ) 电泳(五 ) 固定和染色(六 ) 脱色五 . 操作步骤五 . 操作步骤(一 ). 垂直平板电泳槽的安装注意短玻璃板是向内侧的。要将玻板底边平齐地压紧在红色橡胶条上，否则容易漏胶 。(二 ). 凝胶的制备1 分离胶的制备 (7%) 配 8 mL (按如下顺序加入）1. 分离胶缓冲液 1 mL2. 分离胶贮液 2 mL3. 去离子水 4 mL4. TEMED 2 uL5. 过硫酸胺（ AP) 1 mL将上述试剂迅速混匀后，用滴管沿壁迅速加样至 2/3处，再取大约 3 mL的水加在上面直至凝胶凝固为止。加入此物后请迅速混匀加样，否则易凝固无法加样凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面 .水封的目的是为了使分离胶上缘平直，并排除气泡2.凝聚后倒出上层的高纯水，可用滤纸在边缘吸水。3.浓缩胶的制备 (2.5%) 配 4 mL(按如下顺序加入）1. 浓缩胶缓冲液 0.5 mL2. 浓缩胶贮液 1 mL3. 去离子水 2 mL4. 过硫酸胺（ AP) 0.5 mL迅速混匀 ,用胶头滴管沿壁连续平稳加样到分离胶上面 ,直至上边缘 , 迅速插入加样梳 , 室温静置一段时间 . 加样梳需一次平稳插入 ,梳口处不得有气泡 ,梳底需水平，注意梳子的朝向，平的一面贴长玻板 .凝胶凝 聚后，垂直小心拔出加样梳，用窄条滤纸吸在玻板边缘吸去多余的液体。(三 ). 进 样除去底板，将制胶装置放在电泳槽内， 加入稀释 10倍的 Tris甘氨酸电极缓冲液（注意：加缓冲液先从内槽加入，上面没过短玻璃板，外槽液面没过最下一个螺丝处 , 加样前要使凝胶凹形样品槽内的气泡全部排出 ,否则会影响加样效果 .（用针筒将凹洞中的气泡抽出）用微量进样器取已经混合好的样品 15l ，在距凝胶凹形槽底三分之一处缓缓进样 , 每人加 2个样，两边各留 2 孔不加样，避免边缘效应。 加样时不可过低 ,以防刺破胶体(三 ). 进 样(四 ). 电 泳将电泳仪的正极负极与电泳槽连接（ 方向切勿接错 ），打开电泳仪开关，开始时将电压调至 150V，待样品进入分离胶时，将电压调至 250V。当蓝色染料迁移至 距离凝胶下端 2cm时，将电流调回到零， 关闭电源 。电泳结束后，卸下胶框，用凝胶铲小心撬开短玻璃板，（不要撬两边耳朵处，易断裂） 在胶板一端切除一角作为标记 ，用缓冲液冲洗胶板，将其移至大培养皿中染色。 剥胶时要小心 ,保持胶完好无损 ,染色要充分 .(五 ). 固定和染色将凝胶放入固定染色液中，使染色液刚好没过胶板，放到摇床上，缓慢摇动，染色 7 min。 (注意染色液要用漏斗回收）(六 ). 脱 色放置摇床上，用脱色液漂洗数次，直至背景蓝色褪去。 六 . 实 验 结 果可在培养皿下衬一白纸，便于观察，用手机拍下凝胶图，打印出来附在实验报告后。1、 Acr和 Bis为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作应戴手套。2、玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。 3、安装电泳槽