实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白

实验五实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)动物医学院动物生化教研室1n 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理；n 学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术；n 了解血清蛋白的主要成份。一、实验目的2二、实验原理 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。 3Bis将单体长链连成网状结构TEMED催化 AP生成硫酸自由基1、聚丙烯酰胺凝胶生成催化 Acr聚合成长链Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸胺（催化剂）TEMED： N, N, N,N-四甲基乙二胺（加速剂）Acr、 Bis决定孔径大小AP、 TEMED决定聚合速度4n 连续胶电泳采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统（样品缓冲液、凝胶缓冲液和电极缓冲液），在 pH恒定、离子强度相同的条件下进行。l 优点： 制胶简单、快捷 缓冲液 pH值恒定，可以防止样品进胶后因 pH值改变发生的凝聚和沉淀 缓冲系统组成简单，来源广泛l 缺点： 分辨率不高2、连续胶和不连续胶电泳5n 不连续胶电泳采用不相同孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带，然 后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。l 优点： 分辨率高 用于复杂和特殊样品的分离6l 不连续电泳的三种物理效应 样品的浓缩效应 凝胶的分子筛效应 电荷效应电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离。l不连续电泳的四种不连续体系凝胶的不连续缓冲液成份的不连续缓冲液 pH值的不连续电压梯度的不连续7三、实验步骤n 封槽清洁、干燥的小玻管一端，用 Parafilm贴封后垂直放在管架上 8l 分离胶： A:C:D:E 1:2:3:2（ V/V）l 浓缩胶： B:C:D:E 2:1:5:2（ V/V） A: pH8.9 Tris/Hcl缓冲液 B: pH6.7 Tris/Hcl缓冲液 C: 30% Acr-Bis贮存液 D: 水 E: 过硫酸铵 灌装前加入 TEMED，混匀 取干净玻璃管，下端封口膜封好（ 重要 ）；用注射器加分离胶至管口 1-2cm处，封水（沿管壁，动作要慢）；凝固后弃水、吸干；加浓缩胶距管口 2-3mm处、封水；凝固后备用。制胶和灌胶9n 加样用微量注射器取样品液用微量注射器取样品液 15l ，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上，针头伸入玻璃管上口，沿壁加在浓缩胶面上，缓慢注入。，缓慢注入。n 电泳 连接电极，上负下正；连接电极，上负下正； 浓缩胶：浓缩胶： 3mA管，分离胶：管，分离胶： 4mA管；管； 待示踪染料接近凝胶管底部约待示踪染料接近凝胶管底部约 0.5cm处，切断电源。处，切断电源。n 剥胶取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱 -与管内壁之间与管内壁之间，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水冲洗几次。冲洗几次。10n 染色将凝胶柱置于 0.05% 氨基黑 10B溶液中浸染 20min，然后再浸入 7% 醋酸溶液中 脱色。血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色带。11 分离胶和浓缩胶中 A,B,