实验六-imvic实验

实验六 化学因素对微生物的影响、IMViC与硫化氢试验李晓华、林亲雄、阎春兰实验 32 化学因素对微生物的影响实验目的：了解常用化学消毒剂对微生物的作用实验原理常用的化学消毒剂主要有 重金属及其盐类、有机溶剂（酚、醇、醛等）、卤族元素及其化合物、染色剂和表面活性剂等。重金属离子 ：与菌体蛋白质结合而使之变性或与某些酶蛋白的巯基结合而使酶失活；重金属盐 ：是蛋白质沉淀剂，或与代谢产物发生鳌合作用而使之变为无效化合物；有机溶剂 ：可使蛋白质及核酸变性，也可破坏细胞膜透性使内含物外溢；碘 ：可与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合而使蛋白质失活；氯 ：氯气与水发生反应产生的强氧化剂也具有杀菌作用；染料 ：在低浓度条件下可抑制细菌生长，染料对细菌的作用具有选择性， G 普遍比 G 对染料更敏感；表面活性剂 ：能降低溶液表面张力，这类物质作用于微生物细胞膜，改变其透性，同时也能使蛋白质发生变性。实验步骤培养基 ：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基菌种 ：大肠杆菌溶液或试剂 ：2.5%碘酒、 0.1%升汞、 5%石炭酸（苯酚）、 75%乙醇、 1%来苏尔（甲酚皂消毒液）、 0.25%新洁尔灭（苯扎溴铵溶液）、无菌生理盐水仪器或其他用具 ：无菌培养皿、无菌滤纸片、无菌枪尖滤纸片法测定化学消毒剂的杀 (抑 )菌作用1.熔化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，冷却至 50 左右，在操净台上倒平板， 4个人一组，每人一个平板，水平放置待凝固；2.用无菌枪尖吸取 0.2ml培养 18h的大肠杆菌菌液加入到平板中，用无菌的三角涂棒涂布均匀；3. 已涂布好的平板，将皿底划分成 6等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称；4.用无菌镊子将已灭菌的小圆滤纸片 (5mm)分别浸入装有各种消毒剂的平皿中浸湿，再将浸湿后的滤纸片贴在平板相应区域，在平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照；5.将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于 37 培养箱中，48h后取出观察抑 (杀 )菌圈的大小抑抑 (杀杀 )菌圈的大小，能够反应化学消毒剂抑菌圈的大小，能够反应化学消毒剂抑 (杀杀 )菌能力的大小菌能力的大小思考题1.含化学消毒剂的滤纸片周围形成的抑 (杀 )菌圈表明该区域培养基中的原有细菌被杀死或被抑制而不能进行生长，你如何用实验证明抑 (杀 )菌圈的形成是由于化学消毒剂的抑菌作用还是杀菌作用？2.影响抑 (杀 )菌圈大小的因素有哪些？抑 (杀 )菌圈大小能否准确的反映出化学消毒剂抑 (杀 )菌能力的强弱吗？3.某公司推出一种新饮料，并声称是 100纯天然产品，不含防腐剂，利用你所掌握的微生物学知识，试设计一个简单实验来初步判断此饮料是否含有防腐剂？实验 42 IMViC与硫化氢试验实验目的：学习掌握 IMViC与硫化氢试验原理了解 IMViC与硫化氢试验反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义与方法IMViC是吲哚（ indol）、甲基红（ methyl red test）、伏 -普（ Voges-Prokauer test）和柠檬酸盐（citrate test）四个实验的缩写，主要用于快速鉴别大肠杆菌 和 产气肠杆菌 ，多用于水细菌学检查。硫化氢试验也是检查肠道杆菌的生化试验。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水中超过一定数量，则表示受粪便污染，产气肠杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水时要将两者分开。实验原理：a. Indole Test 吲哚试验 z 吲哚试验是用于检测 吲哚 的产生，某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成 玫瑰吲哚 （红色）z色氨酸 吲哚 玫瑰吲哚吲哚试剂大肠杆菌产气杆菌n 葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 甲基红 -n 葡萄糖 丙酮酸 甲基红 +大肠杆菌产气杆菌b. Methyl Red (MR) Test 甲基红试验甲基红试验是用于检测由葡萄糖产生有机酸如甲酸、乙酸、乳酸等，当 细菌分解糖产酸 ，培养基中的 甲基红指示剂 由橘黄（pH6.3）变为红色（ pH4.2），即甲基红反应。c. Voges-Proskauer (V P) Test 伏普试验是用以检测某些细菌利用葡萄糖产生 非酸性或中性末端产物的能力 ，例如丙酮酸，丙酮酸缩合、脱羧生成 乙酰甲基甲醇 ，在碱性条件下能被空气中的氧气氧化生成 二乙酰 ，后者与蛋白胨中的胍基作用生成红色化合物。葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 二乙酰 红色化合物 +胍基化合物葡萄糖 丙酮酸 大肠杆菌产气杆菌硫化氢试验检测 硫化氢 的产生，细菌分解含硫有机化合物如半胱氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的 铅盐 或 铁盐 等形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。d. Hydrogen Sulfide (H2S ) Production硫化氢试验硫化氢试验I M Vi C试验VP testCitrate utilization testIndol test Methyl testI M Vi C大 肠 杆菌 + + 产 气 肠 杆菌 + +常用于肠道杆菌的鉴定z 培养基 蛋白胨水培养基（吲哚试验）葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验）葡萄糖蛋白胨水培养基（伏普试验）醋酸铅培养基（硫化氢试验）z 菌种 大肠杆菌产气肠杆菌普通变形杆菌操作步骤（ 1）接种与培养用 接种针 将 大肠杆菌、普通变形杆菌 分别穿刺接种于 2支醋酸铅培养基中，置于 37 培养 48 h。（硫化氢试验）用 接种环 将 大肠杆菌、产气肠杆菌 分别接种于 2支蛋白胨水培养基（吲哚试验）， 2支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验）， 2支葡萄糖蛋白胨水培养基（伏普试验） ，37 培养 48h。（ 2）结果观察硫化氢试验 培养 24h后观察黑色硫化铁的产生。吲哚试验 在培养 24h后的蛋白胨水培养基中加入 3-4滴乙醚，摇动数次，静置 1-3min，待乙醚上升后，沿试管徐徐加入 2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。甲基红试验 在培养 24h后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加入甲基红试剂 2滴，培养基变红者为阳性，变黄者为阴性。（注意：甲基红试剂加得过多，可出现假阳性现象。）伏普试验 在培养 24h后的葡萄糖蛋白胨水培养基内加入5 10滴 40 KOH，然后加入等量的 5 -萘酚溶液，用力振荡，再放入 37 温箱中保温 15 30分钟。反应物呈红色者，为伏普反应阳性。思考题n 1讨论 IMViC试验在医学检验上的意义。n 2解释在细菌培养中吲哚